miR-155调控髓源性抑制细胞对脓毒症晚期小鼠免疫抑制的实验研究

Immunosuppression is an important cause of secondary nosocomial infection and high mortality in late sepsis, studies have found that the abnormal expression and activation of myeloid derived suppressor cells (MDSCs) are closely related to the immunosuppression of sepsis. miR-155 plays an important role in the regulation of immune response, our research group have confirmed that miR-155 can regulate the immune response mediated by macrophages and reduce acute lung injury in sepsis.Our preliminary experiment have found that the proportion of MDSCs in the late model of sepsis is significantly increased and the expression of miR-155 is up-regulated. miR-155 may be involved in late sepsis immunosuppression mediated by MDSCs. To test this hypothesis, this project aims to study the effect of miR-155 on the proliferation and activation of MDSCs and elucidate its molecular regulation mechanism by means of RNA interference, gene overexpression and T cell co-culture, and explore the role of miR-155 on MDSCs-mediated late sepsis immunosuppression through miR-155 transfection in vivo.This study is of great significance for studying the pathogenesis of late sepsis immunosuppression and the exploration of new treatment of sepsis.

免疫抑制是脓毒症晚期继发院内感染及高病死率的重要原因，研究发现髓源抑制细胞（MDSCs）异常表达和活化与脓毒症免疫抑制密切相关。miR-155 在免疫反应的调节中起重要作用，本课题组既往研究证实miR-155可以调控巨噬细胞介导的免疫反应，减轻脓毒症急性肺损伤。我们预实验发现脓毒症晚期小鼠模型中MDSCs比例显著增加，并伴miR-155表达上调。 miR-155可能参与了MDSCs介导的脓毒症晚期免疫抑制反应。为验证这一假说，本申请项目拟通过构建小鼠脓毒症晚期动物模型，提取MDSCs，采用RNA干扰、基因过表达和T细胞共培养等手段，系统研究miR-155对MDSCs增殖、活化的影响，阐明其分子调控机制；进一步通过体内转染miR-155，深入探讨其在MDSCs介导的脓毒症晚期免疫抑制中的作用。该研究对脓毒症晚期免疫抑制的发病机制及探索脓毒症新的治疗方法具有重要意义。

髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）是一类异质性的未分化成熟的骨髓来源的细胞，在脓毒症免疫抑制阶段显著增加。近年来有研究发现，CD49d+ MDSC相较于CD49d- MDSC而言，具有更强的免疫抑制作用。在本研究中，我们选择入院天数大于21天的脓毒症患者为脓毒症晚期患者，选其外周血作为样本，运用流式细胞术检测其外周血中CD49d+ MDSC比例的变化。同时在体内实验部分，我们通过观察盲肠结扎穿孔术（Cecal ligation and puncture, CLP）小鼠术后不同时间内的免疫细胞（MDSCs、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞）的数量变化确定脓毒症小鼠早、晚期，并分析脓毒症早、晚期小鼠脾、外周血及骨髓中CD49d+ MDSC数量变化，经流式细胞分选术获得CD49d+ MDSC来对其进行免疫抑制功能分析。我们按原计划开展了实验研究，并取得了预期的研究成果。（1）脓毒症晚期患者外周血的CD49d+ MDSC阳性率明显高于入院天数小于21天的脓毒症患者组及健康对照组；（2）我们通过流式细胞术检测盲肠结扎穿孔术（Cecal ligation and puncture, CLP）术后不同时间段小鼠的脾、外周血中MDSCs、T细胞、NK细胞，骨髓中MDSCs的比例，发现术后10天小鼠处于脓毒症晚期阶段；（3）通过流式细胞术发现，与脓毒症晚期患者类似，脓毒症晚期小鼠的骨髓、脾及外周血中的CD49d+ MDSC也明显升高，经流式细胞分选术获得小鼠脾脏中的CD49d+ MDSC和CD49d- MDSC后，检测Arg-1、NOS2、IDO1的mRNA水平检测，结果发现CD49d+ MDSC组的免疫抑制基因表达高于CD49d- MDSC组。实验结果表明，CD49d+ MDSC无论在脓毒症晚期的患者还是小鼠体内的表达均明显升高，且其免疫抑制基因表达明显增强，可能为脓毒症晚期免疫抑制功能亢进提供诊断和治疗靶点。