狨猴iPS细胞表观遗传特性分析及其再分化为神经祖细胞的机制研究

Among the various species from which induced pluripotent stem cells have been derived, nonhuman primates (NHPs) have a unique role as pre-clinical models. Their relatedness to humans and similar physiology, especialy central nervous system, make them ideal for translational studies. When iPS cells are derived from the skin cells of an individual patient, they should be able to be transplanted back to the same patient without rejection. Before this is applied to human patients, the properties of iPS cells must be thoroughly explored in suitable animal models. In the proposed research, we will focus on iPS cells derived from marmoset, NHPs in which several human disease states can be modeled. We will assess the characteristics（for example, epigenetic） of iPS cells with different passages, meanwhile we will assess the ability of its differentiation into neural progenitor cells. The neural progenitor cells will be transplanted into the central nervous system of immunodeficient mice. This proposal may provide an insight into the new application of iPS to neuron system diseases.

再生医学因其可以修复受损的组织或器官，成为当今生物学和医学研究的热点。.但再生医学面临的主要问题是所使用的细胞来源。一般认为取自病人自身的细胞最好，可以避免免疫排斥反应。诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)的出现使得这一问题得以解决。在iPS细胞真正应用于人类疾病治疗之前，必须在适宜的动物模型中对iPS细胞进行系统而深入的研究，在诸多动物模型中，非人类灵长类狨猴因其与人类具有较近的亲缘关系和相似的生理特性，尤其是在中枢神经系统的相似性，被认为是最适宜临床前试验的最理想生物医学模型。基于这些理论依据，本项目拟研究体外培养不同传代次数的狨猴iPS细胞的特性（如表观遗传等）及其再分化为神经祖细胞的特性，并对其进行鉴定，应用细胞移植方法将iPS来源的神经祖细胞移植到免疫缺陷小鼠的中央神经系统，鉴定其在动物体内的功能特性，探索iPS治疗神经疾病的新技术方法，为应用细胞替代治疗神经系统疾病开辟新途径。

iPS技术不但可以解决ES细胞在应用上的来源和伦理道德等局限，而且开辟并延伸了干细胞研究和应用领域的新前沿，为疾病的防治提供了新途径。在iPS细胞真正应用于人类疾病治疗之前，尚需要建立适宜的动物模型对iPS细胞进行系统而深入的研究。基于此，本项目以狨猴iPS细胞为研究对象，首先借助高通量测序结合生物信息学的方法，分析比较了不同传代次数的狨猴iPS的基因表达状况及表观遗传特性，同时比较研究了不同传代次数的狨猴iPS细胞体外诱导分化为神经祖细胞(NPCs)的能力及特性，以及狨猴iPS再分化为NPCs的基因表达情况。另外，将不同iPS-NPCs移植到SD大鼠大脑皮层，分析其分化增殖特性。RNA-Seq测序结果表明，随着传代次数的增加部分基因的表达发生变化，其中包括多能性相关基因，如TBX-3等。实时定量PCR验证多能性相关基因表达变化与测序结果一致，证实测序结果的可靠性。同时，MeDIP-Seq结果也显示，不同传代次数的狨猴iPS细胞间存在表观遗传差异。鉴于此，为了建立稳定而高效的iPS体外培养体系，我们尝试在培养液中添加ROCK激酶抑制剂Y27632，并且探讨了其在狨猴iPS细胞培养过程中的作用。研究结果表明，Y27632能通过抑制Caspase-3的活性抑制细胞凋亡，从而促进细胞增殖，此结果为狨猴iPS细胞长期培养奠定基础。在上述基础上，通过数字表达谱方法研究了不同传代次数的iPS细胞体外分化为神经祖细胞的基因表达情况，结果表明，不同传代次数(P4和P16)来源的NPCs间基因表达未见差异，把经BrdU标记后的NPCs移植到SD大鼠大脑皮层后，切片免疫组织化学分析发现，移植的NPCs能够存活并分化为神经元样细胞。总之，研究结果提示，虽然不同传代次数狨猴iPS间的基因表达及表观遗传有差异，但并未影响其向NPCs分化后基因表达状况；狨猴iPS分化的NPCs移植到大鼠大脑皮层内能存活，且具有分化能力；添加Y27632的iPS体外培养体系可能更适于狨猴iPS细胞体外长期培养。项目的完成最终为iPS技术建立非人类灵长类神经系统疾病自体细胞治疗的模型提供新思路和理论依据。