细胞共培养体系用于补肾中药调控骨重建的药效评价

骨重建是由成骨和破骨细胞介导的功能耦联过程，骨重建失衡是骨质疏松的关键致病因素。补肾中药广泛用于临床治疗骨质疏松，可调节骨重建多环节，但目前对其研究以单细胞评价模型为主，且对其多靶点成分的认识不够充分和深入。本课题拟建立成骨前体-骨髓间充质干细胞（MSCs）、前破骨的血源性单核细胞、调控骨微环境的雌激素释放细胞－卵泡颗粒细胞的三细胞共培养模型，反映骨向分化、骨吸收、骨形成及内分泌激素整体调节的动态过程，实现骨重建的体外细胞模拟。此模型以三细胞为整体功能单元，形成多靶点整合环境，为调控骨重建的中药多靶成分发现提供良好的评价体系。在不同功效指标可同时分析基础上，利用各种化学计量学数据处理手段，将多指标用一个综合指标代替，可实现补肾中药组分调控骨重建平衡的综合效应评价，有利于阐明其整合作用机理。本研究为调控骨重建的中药研究提供了新的评价思路和方法体系，对于防治骨质疏松的创新中药研发具有推动作用。

骨重建是由成骨和破骨细胞介导的功能耦联过程。临床治疗骨质疏松的补肾中药，可调控骨重建的多环节，但目前细胞单培养的骨重建体外模型一定程度上限制了补肾中药多靶点活性成分的认识与发现。本项目针对骨重建的发生发展机制，建立了骨重建的多细胞共培养模型，分析了共培养体系生物学特性，发展了多指标同时分析的方法，并系统评价了多种补肾中药包括淫羊藿、墨旱莲等，结合化学计量学方法，发现了具有调控骨重建作用的多靶点活性成分。首先，我们建立了成骨细胞前体—骨髓间充质干细胞和前破骨细胞RAW264.7或血液单核细胞直接接触共培养，释放雌激素的卵泡颗粒细胞通过0.4 µm孔径的transwell板间接接触培养，通过优化培养时间、培养条件（加入骨分化诱导剂诱导12 d、破骨细胞分化诱导剂RANKL诱导6 d）、细胞数量及代数等条件，建立了三细胞共培养体系。建立了以pNPP为底物的破骨分化标志酶抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP定量、骨分化标志酶碱性磷酸酶ALP染色计数定量、同时培养液上清检测雌二醇水平的定量方法。结果揭示细胞通过共培养影响了彼此的功能活性，上调了ALP水平，刺激了雌二醇的含量。为了进一步评价共培养体系对药物活性影响，利用抗吸收药物阿仑膦酸钠和骨形成制剂PTH对共培养体系评价，证实了共培养体系更接近体内状态，更加真实的反映了药物的活性及副作用。其次，系统评价了淫羊藿、墨旱莲等中药，发现淫羊藿中的淫羊藿苷在共培养体系上上调了ALP活力、抑制了TRAP活力；淫羊藿次苷II和淫羊藿素抑制破骨细胞活性更强，并可协同抑制RAW264.7细胞增殖，提示这可能是淫羊藿多成分、多靶点作用机制之一。另外，我们首次发现墨旱莲提取物及蟛蜞菊内酯抑制RAW264.7细胞增殖及TRAP活力。最后，为了解决多指标评价以发现多靶点活性成分（群）的问题，发展了四个基于Matlab工具箱用于定量模式活性关系的相关研究。应用模型群体分析方法建立了不同产地淫羊藿色谱图与破骨细胞抑制活性的关联关系，发现了最为相关的3个活性成分，并通过了单体活性验证。总之，我们建立的三细胞共培养体系更加接近骨重建的体内状态，可作为评价中药活性的体外高通量筛选模型，有利于发现中药的多靶点活性成分，其中墨旱莲和淫羊藿中的多种单体成分值得深入研究。本项目共发表文章6篇，其中4篇SCI文章，1篇中文核心期刊论文，1篇会议论文。申请专利2件。