应用遗传修饰乳酸菌分泌表达体系研究肽酶降解干酪苦味肽机理

苦味是干酪风味缺陷中最基本的一种。本研究利用同源整合载体pG+host获得胸苷酸合成酶（thyA）基因缺陷型乳酸菌菌株作为受体菌。将分离自中国传统乳制品中具有高肽酶活性乳酸菌的氨肽酶和内肽酶基因克隆入以thyA基因为选择标记的非抗生素抗性乳酸菌分泌表达载体中，构建并鉴定阳性表达质粒，电转化入目的受体乳酸菌中，获得可分泌表达系列肽酶基因的食品级重组阳性乳酸菌。利用遗传修饰的乳酸菌分泌表达体系靶向研究各肽酶在模拟干酪成熟条件的缓冲体系中和干酪浆中的酶活性和对苦味肽的降解作用，探讨肽酶在干酪成熟过程中控制苦味的机理，为促进干酪成熟过程中蛋白质的水解，降低干酪苦味，改善干酪风味提供理论基础。

以L.lactis NZ9000基因组DNA为模板扩增得到胸苷酸合成酶（thyA）基因部分区域缺失的上下游片段（Up, Down）。构建了同源重组质粒pCS-Up-Down，电转化入L.lactis NZ9000感受态细胞中，筛选获得thyA基因缺陷菌NZ9000ΔthyA。将扩增到的嗜酸乳杆菌thyA基因完整片段克隆入乳酸菌表达载体pTH8048中取代抗性基因片段获得质粒pTH8048-thyA，电转化NZ9000ΔthyA受体菌中获得食品级重组菌pTH8048-thyA/NZ9000ΔthyA。将分离鉴定的并且具有高肽酶活性的副干酪乳杆菌的肽酶pepO和pepE2基因片段分别克隆入质粒pTH8048-thyA中获得非抗生素抗性标记且可表达pepO和pepE2的重组菌。应用高效液相色谱分别对重组菌的菌体细胞抽提液在干酪模拟环境中和在干酪浆中对苦味肽αs1-CN（f1-9）的水解作用进行了测定。研究初步揭示了经遗传修饰的乳酸菌表达体系表达的肽酶可以水解干酪中苦味肽。探讨了建立的食品级乳球菌表达体系在控制干酪苦味方面的作用。研究为研制风味优良的干酪提供了重要参考。