核仁素（NCL）与miR-221相互作用调控急性白血病耐药的研究

Adult acute leukemia (AL) have higher relapsed rate and lower 5-year overall survival (OS). Preliminary experimental results showed that nucleolin (NCL) and miR-221 were over-expressed in resistant leukemic cell lines. Refractory or relapsed AL patients had higher positivity of miR-221 and NCL expression than newly diagnosed patients, but the exact mechanism is not yet clear. The project were be carried out from three aspects: to detect NCL/ miR-221 expression levels in AL patients, experimental studies of cell lines in vitro and of NOD/SCID mice xenograft in vivo. The project intends to use RNA interference and over-expression technology, to observe resistant phenotypes of AL cells by up-regulation/down-regulation NCL/ miR-221 in HL-60 and adriamycin-resistant HL-60 cell (HL-60/ADR)、Molt-4 and adriamycin-resistant Molt-4(MAR). The interaction between NCL and miR-221 and its involvement in drug resistance was aiso investigated. It would provide a new clue for monitoring the drug resistance and evaluating prognosis in AL.

成人急性白血病（AL）复发率高，5年总生存率（OS）较低，对化疗药物产生耐药是AL治疗失败的主要原因之一。前期的预实验结果显示，核仁素（NCL）及miR-221在耐药的白血病细胞株高表达，并且复发/难治患者的阳性率也明显高于初治患者，两者间的表达呈一定程度的相关性，NCL与miR-221如何相互作用？如何影响白血病的耐药性？目前均未明了。本项目拟从患者表达水平检测、细胞体外实验及动物体内实验三大方面进行研究，采用干扰及过表达技术，以HL-60细胞及耐阿霉素的HL-60细胞(HL-60/ADR)、Molt-4及其耐阿霉素的细胞（MAR）为研究对象，观察上调/下调NCL基因及miR-221对白血病细胞耐药表型的影响，将从新的角度探讨NCL及miR-221的相互作用对白血病耐药的影响及其分子机制。为指导AL分层治疗，疗效监测、预后判断，具有重要的临床实际意义和应用价值。

成人ALL治疗效果欠佳，5年OS低，预后不良，对化疗耐药是治疗失败的主要原因。本项目从临床和基础研究两方面探讨NCL与miR-221相互作用调控白血病耐药的机制。具体如下：（1）核仁素（NCL）在耐药白血病细胞株中高表达，在初治和复发难治患者中的表达高于完全缓解（CR）的患者，在不同疾病分期的表达具有显著差异。多因素分析显示，年龄和NCL阳性表达水平独立于其他常见预后因子，与不良的 OS 相关，提示NCL可作为新的ALL预后标志。（2）在T-ALL细胞株Jurkat中过表达NCL后，过表达组OE较对照组ONC对阿霉素（ADM）的IC50升高8.42倍。相反，NCL基因沉默组（KD）较无义序列转染组（Scr）的IC50降低2.32倍。OE组较ONC组的细胞增殖能力升高，72h细胞增殖率升高达2倍；KD组细胞增殖率下降，72h增殖率仅为Scr组的66%。克隆形成实验与细胞生长曲线的结果相一致。Jurkat/KD 组细胞存在 G2/M 期阻滞。Jurkat/Scr和Jurkat/KD细胞的凋亡率分别为 14.08%±2.40%、24.55%±0.96%，NCL基因沉默后细胞凋亡活动显著增高。在另外两株T-ALL细胞Molt-4和Nalm-6中得到了相似的结果。（3）过表达NCL可以上调转运蛋白BCRP的表达，二者存在蛋白-蛋白相互作用，促进耐药的发生并引起Raf/MEK/ERK信号通路的改变。（4）过表达miR-221 后Molt-4细胞对ADM的IC50较空载体组增加2倍，细胞增殖能力提高，细胞凋亡率降低，miR-221上调可引起NCL及BCL-2的表达上调。（5）针对NCL的适配体AS1411联合化疗在小鼠体内起到显著的抗白血病作用。小鼠移植瘤模型中，ADM+AS1411联合用药组的肿瘤生长抑制率显著高于为AS1411和ADM的单药治疗组及对照核酸组。小鼠原位白血病模型中，ADM+AS1411双药联合治疗组较Vehicle组和ADM组显著延长其生存时间。综上所述，本研究显示NCL可作为MRD监测指标和预后判断的指标之一，并为治疗ALL提供新的治疗靶点。现已按计划完成既定目标，已发表3篇SCI论文，另有一篇SCI论文已被接收待发表，还有部分实验结果已整理成文投稿中，已培养毕业2名博士研究生。