氧调控性bFGF基因修饰神经干细胞脑内移植在大鼠大脑中动脉永久性闭塞模型中的神经保护作用

脑血管病是我国第一大致死疾病，多为缺血性脑卒中。临床虽有多种治疗手段，结果却并不令人满意。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）可促进血管生成，保护神经元，动员内源性神经干细胞，具有较好的应用价值。但bFGF静脉给药半衰期短，难以透过血脑屏障，全身不良反应多。通过基因治疗在局部表达bFGF可克服静脉给药的不足，但常规基因治疗载体目的基因表达不具可调控性，长期过表达bFGF存在致瘤的风险。我们前期成功构建低氧诱导bFGF表达腺病毒载体，有效解决这一难题。但病毒载体在脑组织中扩散范围有限，治疗作用难以充分发挥。神经干细胞因免疫源性低、可在脑组织中定向迁移、能被诱导分化为神经元，是理想的基因治疗载体。本课题拟构建低氧诱导bFGF基因修饰神经干细胞，移植于大鼠大脑中动脉永久性闭塞模型(pMCAO）脑缺血半影区，通过神经功能缺损评分和脑梗塞面积测量等考察其神经保护作用，将为缺血性脑卒中治疗提供新的思路。

缺血性脑卒中等脑组织损伤释放大量兴奋性神经递质与氧自由基等，不利于移植神经干细胞的存活，且最终仅有极少部分能分化为神经元。而碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能显著促进神经干细胞的迁移、增殖与分化。利用缺血性脑卒中局部脑组织中的缺血缺氧微环境，本课题组探索低氧调控性bFGF基因治疗联合神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中的新思路。.采用Invitrogen公司的无启动子慢病毒包装系统，通过多步骤基因重组，成功构建携带基因表达调控元件5HRE-bFGF的重组慢病毒载体，将其与慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞，成功包装并获得重组慢病毒颗粒。重组慢病毒侵染C17.2神经干细胞后，通过杀稻瘟菌素淘汰筛选获得被重组慢病毒感染的细胞。通过梯度稀释法，获得一系列基因修饰神经干细胞单克隆，进一步通过免疫印迹法，从中筛选常氧情况下几乎不表达bFGF，而在低氧环境下bFGF表达显著上调的单克隆神经干细胞。.线栓法成功制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注损伤模型（MCAO），造模后24h，通过尾静脉注射将bFGF基因修饰神经干细胞静脉移植入MCAO大鼠体内，神经功能缺损评分结果表明：bFGF基因修饰组神经功能恢复显著优于对照组hrGFP基因修饰组。TTC染色结果显示：bFGF基因修饰组与hrGFP基因修饰组之间脑梗死面积无显著性差异。CM-DiI标记荧光检测结果表明，与hrGFP基因修饰组相比，bFGF基因修饰显著增加了缺血损伤区中移植神经干细胞的数量，提示bFGF可促进移植神经干细胞在MCAO大鼠缺血缺氧脑组织中的存活、迁移与增殖。免疫荧光检测结果显示：仅有极少hrGFP基因修饰神经干细胞分化为神经元（NeuN），多数仍维持神经干细胞特性（Nestin）；而bFGF基因修饰神经干细胞分化为神经元的比例显著增加。但分化为星形胶质细胞（GFAP）的比例，二组之间无显著性差异。将bFGF基因修饰神经干细胞移植于大鼠MCAO同侧脑室，获得较静脉移植更优的神经功能改善。.然而，bFGF基因修饰神经干细胞移植促进MCAO大鼠神经功能改善的最佳细胞数量、移植时间、移植途径仍需后续进一步优化确定，且bFGF基因修饰神经干细胞移植后的长期治疗作用，以及是否存在向肿瘤细胞的恶性转化仍有待进一步研究。.项目实施以来，发表SCI论文1篇，已投稿SCI论文1篇，另一篇SCI论文正在撰写中，培养硕士研究生2名。