桦褐孔菌种质资源遗传多样性及菌核发育基因研究

桦褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát是十分珍稀而又名贵的药用真菌，仅分布在北半球的少数国家，以其菌核入药，野生资源濒临灭绝，菌核人工栽培虽然取得成功，但由于生物学效率低尚未实现规模化栽培。优良菌株的培育是实现桦褐孔菌菌核人工规模化栽培的前提，而桦褐孔菌育种工作的研究目前尚属空白。本项目拟采用ISSR及SRAP分子标记技术对从国内外收集到的桦褐孔菌菌株进行遗传多样性分析，以求对其种质资源遗传多样性作出科学评价，并根据分析结果从中选择遗传距离较远且菌核发育特性较强的菌株进行人工栽培，探明菌核发育期间胞外酶活性变化规律，确定2-3个关键酶，参照真菌胞外酶的核苷酸序列进行比对，克隆相关基因片段，采用半定量RT-PCR方法研究全长基因的表达特性，分析菌核发育基因差异，揭示菌核发育的分子机理,研究结果可为桦褐孔菌种质资源的科学利用及菌核人工规模化栽培提供理论依据。

桦褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát是十分珍稀而又名贵的药用真菌。本项目采用ISSR、SRAP以及RSAP技术对20个桦褐孔菌菌株的相似系数进行了聚类分析；以采自5个不同国家及地区的桦褐孔菌菌株为试验材料，进行代料栽培，测定多种胞外酶活性在菌核生长发育过程中的活性变化情况；根据胞外酶活性变化与菌核形成时期的关系，找出控制菌核形成的关键酶-漆酶、蛋白酶和纤维素酶，克隆全长关键酶基因，并进行相关的生物信息学分析；利用荧光定量PCR技术研究关键酶基因在菌核形成期间的表达量变化情况。结果表明，20个供试桦褐孔菌菌株划为6大类群；桦褐孔菌菌株代料栽培过程中以分解非木质素类物质为主要营养来源，但菌核形成时期充足的木质素营养是形成菌核的决定性因素；菌丝生长与淀粉酶活性呈现正相关；菌核形成时期漆酶活性决定是否形成菌核，菌核产量与纤维素酶及蛋白酶活性成正比关系；内切葡聚糖酶基因的基因组DNA全长序列大小为1966bp，cDNA序列的全长为1233bp，编码410个氨基酸，该基因包含14个外显子和13个内含子；β-葡萄糖苷酶基因包含14个外显子和13个内含子，基因组DNA全长序列大小为3382bp ，cDNA序列的全长2583bp，编码860个氨基酸；酸性蛋白酶基因cDNA序列全长为990bp，编码330个氨基酸；桦褐孔菌菌核发育期间关键酶基因的表达量变化，发现内切葡聚糖基因在菌核发育到190天时表达量依旧在升高，而β葡萄糖苷酶基因在170天时达到最大值，在190天时表达量有所下降，从分子水平表明纤维素酶基因的表达水平与菌核产量存在正相关性，为深入研究纤维素酶基因的功能以及提高菌核产量提供了理论依据。