BAG3介导奶牛瘤胃上皮细胞抗凋亡的调节机制

Rumen health and homeostasis are critical basis for high yield of dairy cows. Our previous study firstly found that Bcl-2 Associated Athanogene 3 (BAG3)-mediated cell anti-apoptotic pathway is closely related to rumen epithelial homeostasis. However, the molecular mechanism of its anti-apoptotic effect in rumen epithelial cells is unclear. Based on the mitochondrial apoptosis pathway mediated by BAG3, a rumen epithelial cell proliferation-apoptosis imbalance model will be used to investigate its effects on the activation of the BAG3 and Bcl-2 family in the primary cultured rumen epithelial cells of cows. Then, the anti-apoptotic mechanism of BAG3 in rumen epithelial cell under the molecular and cellular levels will be evaluated using gene silencing, gene overexpression, CRISPR/Cas9 gene knockdown and other molecular biology techniques, combined with cell biology, transcriptomics and metabolomics. And the molecular mechanism of the BAG3’s effects on downstream pathways will be also detected. The objective of this project is to elucidate the regulation mechanism of BAG3-mediated anti-apoptotic pathways in rumen epithelial cell of dairy cows, to provide new ideas and molecular regulatory targets for ensuring rumen epithelial health and homeostasis in dairy cows, and to provide theoretical knowledge for healthy and efficient production of dairy cows.

瘤胃健康及稳态是奶牛高产的重要基石。申请人前期首次研究发现Bcl-2关联永生基因（BAG3）介导的细胞抗凋亡途径与瘤胃上皮稳态密切相关。然而，BAG3在瘤胃上皮细胞中发挥抗凋亡作用的分子机制尚不清楚。本项目在原代培养奶牛瘤胃上皮细胞基础上，基于BAG3介导的细胞线粒体凋亡途径，研究瘤胃上皮细胞增殖-凋亡失衡对BAG3和Bcl-2家族激活状况的影响，利用基因沉默、基因过表达、CRISPR/Cas9基因敲除等分子生物学技术，并结合细胞生物学、转录组学和代谢组学，在分子和细胞层面研究BAG3抗瘤胃上皮细胞凋亡及对下游通路的作用及影响机制，阐明BAG3介导奶牛瘤胃上皮细胞抗凋亡的调节机制，为维持奶牛瘤胃上皮健康和稳态提供新思路和分子调控靶点，为奶牛健康高效生产提供理论基础。

瘤胃作为反刍动物最重要的消化器官，是提高生产性能的重要基石。前期研究发现，BCL2关联永生基因（BAG3）介导的细胞抗凋亡途径与瘤胃上皮稳态密切相关，为了探究BAG3及BCL2在瘤胃上皮中抗凋亡的分子机制，本项目以瘤胃上皮细胞系为材料，结合首先构建了氧化应激诱导的瘤胃上皮细胞凋亡模型，并在这个模型的基础上，对BCL2基因进行敲降，BAG3蛋白进行抑制处理，探究了BCL2和BAG3在瘤胃上皮细胞抗凋亡中的作用，结果显示，对BCL2和BAG3功能的抑制均显著提高了瘤胃上皮细胞在应对氧化应激时的凋亡细胞比率和细胞死亡率（P＜0.05），提示BCL2和BAG3在瘤胃上皮细胞抗凋亡途径中具有关键作用。随后，我们通过转录组测序技术（RNA-seq）,探究了BCL2敲降和BAG3抑制后细胞的转录组变化情况，结果显示，BCL2敲降组与对照组相比，共有888个上调基因，2012个下调基因（FDR＜0.05，log2FC＞2），通过KEGG富集分析，差异基因被富集到TGF-β信号通路等信号通路（q＜0.05），主要集中于细胞修复、免疫、肿瘤、细胞增殖等相关通路；BAG3抑制组与对照组相比，共有1139个上调基因，1490个下调基因FDR＜0.05，log2FC＞2），通过KEGG富集分析，差异基因被富集到FoxO信号通路等信号通路（q＜0.05）。此外，为结合体内情况分析，我们进一步开展动物试验（高能饲喂处理组：HE组，对照组：HF组），探讨高能饲粮诱导瘤胃内环境紊乱条件下，瘤胃上皮组织的转录组变化，结果发现有3个上调基因和23个下调基因，差异基因被富集在补体系统等五条通路上。综上所述，本研究对瘤胃上皮细胞抗凋亡可能的机制做了初步探讨，明确了BAG3及BCL2在瘤胃上皮细胞抗凋亡途径的作用，BCL2和BAG3可能主要通过影响细胞正常的修复、免疫和增殖来调控瘤胃上皮细胞的增殖-凋亡稳态，本研究维持奶牛瘤胃上皮健康和稳态提供新思路和分子调控靶点，为奶牛健康高效生产提供了理论基础。