周期性机械应力促进软骨细胞功能的机制研究

Recent studies showed that periodic mechanical stress could significantly promote chondrocyte proliferation and matrix synthesis. However, the mechanisms underlying the ability of chondrocytes to detect and respond to periodic mechanical stress have not been well delineated. We confirmed that ERK1/2 mediated mechanical stimulation-initiated chondrocyte proliferation and matrix synthesis in our just finished National Natural Science Foundation. However, the upstream signaling proteins of ERK1/2 have yet to be explored. Based on our previous study, we demonstrate a hypothesis that periodic mechanical stress could promote chondrocyte proliferation and matrix synthesis through integrin→FAK/Src→Rac1→PLCγ1→ERK1/2 signaling pathway. In order to verify the above hypothesis, we adopt the selective inhibitors, shRNA and point mutation techniques to inhibit the activation of the above signaling proteins, and we use Western bloting and Real-time PCR to determine the role of the signaling proteins in periodic mechanical stress-upregulated chondrocyte proliferation and matrix synthesis, including the nature of any functional association among the signaling proteins. Then, we upregulate the expression of integrin in chondrocytes to build high-quality tissue-engineered cartilage to repair articular cartilage defects. This study will lay the foundation for further investigations regarding chondrocyte mechanobiology under periodic mechanical stress and how to improve the quality of tissue-engineered cartilage.

近来发现，周期性机械应力能促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成，但其机制尚不十分明了。我们在刚刚结题的国家自然科学基金中证实，ERK1/2在周期性应力引起软骨细胞增殖和细胞外基质合成中发挥了重要的作用，但是ERK1/2的上游信号蛋白尚不清楚。在前期研究的基础上，我们提出了如下假说，周期性应力通过整合素→FAK/Src→Rac1→PLCγ1→ERK1/2信号通路促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成。为了验证上述假说，我们拟采用相应的抑制剂、shRNA干扰和点突变技术阻断相应信号蛋白的活化，通过Western bloting和Real-time PCR等检测方法，以确定相应信号蛋白在周期性机械应力促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用，以及相应信号蛋白之间的上下游关系。然后，我们将上调软骨细胞中整合素表达，构建高质量组织工程软骨修复关节软骨缺损，为进一步深入探讨如何提高组织工程软骨的质量奠定基础。

周期性机械应力已被证实能促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成，但其机制.尚不十分明了。我们之前的研究证实ERK1/2在周期性应力引起软骨细胞增殖和细胞外基质合成中发挥了重要的作用，但是ERK1/2 的上游信号蛋白尚不清楚。在前期研究的基础上，我们提出了如下假说，周期性应力通过整合素→FAK/Src→Rac1→PLCγ 1→ERK1/2 信号通路促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成。进而我们上调软骨细胞中整合素表达，观察周期性机械应力下构建的组织工程软骨质量。为了验证上述假说，我们首先采用相应的抑制剂、shRNA干扰和点突变技术阻断相应信号蛋白的活化，通过Western bloting、Real-time PCR 及CCK-8等检测方法，以确定相应信号蛋白在周期性机械应力促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用，以及相应信号蛋白之间的上下游关系。我们发现周期性机械应力能通过激活Integrinβ1-FAK（Tyr397）-ERK1/2、Integrinβ1-Src-Rac1-FAK(Tyr576/577)-ERK1/2及Integrinβ1-Src- PLCγ1-ERK1/2三条信号通路来促进软骨细胞增殖及细胞外基质合成。由于Integrinβ1已被我们证实是软骨细胞表面一个重要的机械感受器,我们还额外研究了与Integrin密切相关的一个蛋白ILK（integrin-linked kinase）在软骨细胞的机械信号传导通路中发挥的作用。我们发现周期性机械应力也能通过激活Integrinβ1-ILK- ERK1/2通路来促进软骨细胞增殖及细胞外基质合成。进而我们通过shRNA干扰和点突变技术分别上调及下调软骨细胞中Integrinβ1的表达，通过HE染色、番红染色、免疫组化染色等检测方法，确定周期性机械应力下构建的组织工程软骨质量的变化。我们发现在周期性机械应力下，相比于空白对照组，Integrinβ1过表达组的组织工程软骨质量明显增高，Integrinβ1阻断组的组织工程软骨质量明显降低。我们的研究结果将为进一步深入探讨如何提高组织工程软骨的质量奠定基础。