蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制因子调控寄主血淋巴黑化的机理

采用转录组学、蛋白质分离与鉴定、基因克隆与表达、酶学与功能活性测定、及蛋白质相互作用研究等技术，在明确菜粉蝶重要蛹期内寄生蜂蝶蛹金小蜂毒液蛋白组成的基础上，筛选并克隆其毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins）的编码基因，探明serpins家族基因转录与表达的时空变化，进而对serpins基因进行真核表达，测定重组表达产物的底物谱及其功能，并研究其与寄主血淋巴蛋白的互作，明确其作用的靶蛋白酶。最终，解析该寄生蜂毒液serpins抑制寄主血淋巴黑化反应的分子机理。一方面可为进一步深入揭示寄生蜂毒液组成与功能，及昆虫先天免疫反应的过程与机理提供新理论与新方法；另方面也可为建立以害虫先天免疫系统为靶标的新型杀虫剂－免疫抑制剂的先导化合物高通量筛选平台，以及基于抑制先天免疫反应的新型害虫生物防治策略的研究奠定理论基础与技术支撑。最终为我国"绿色农业"生产与可持续发展提供害虫控制的新策略与新途径。

本项目就寄生蜂与寄主相互作用机制之科学问题，以蝶蛹金小蜂及其寄主菜粉蝶蛹为研究对象，采用基因组学、转录组学、蛋白质组学、蛋白质分离与鉴定、基因克隆与表达、western blot、定量PCR、酶学及功能活性测定和蛋白质相互作用等技术，开展了研究蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制因子调控寄主血淋巴黑化的机理系列研究，主要获得了以下重要成果：第一，在分析了蝶蛹金小蜂雌蜂毒腺特异性表达谱以及毒液蛋白的组成的基础上，筛选获得蝶蛹金小蜂毒液源丝氨酸蛋白酶抑制因子PpSPN1、PpSPN2和PpSPI。第二，分别克隆了编码PpSPN1、PpSPN2和PpSPI的cDNA全序列，序列分析结果表明PpSPN1和PpSPN2隶属大分子丝氨酸蛋白酶抑制因子serpin家族成员，而PpSPI则隶属pacifastin类小肽。第三，对3个及基因分别进行了亚克隆，并对其进行了大肠杆菌表达，其中PpSPN2和PpSPI基因可通过大肠杆菌表达获得可溶性重组蛋白，而PpSPN1的重组表达产物则位于大肠杆菌的包涵体内；对3个基因的表达产物分别进行纯化，获得重组蛋白，并制备了针对3个基因所编码蛋白的多克隆抗体。第四，明确了该3个基因在蝶蛹金小蜂雌成蜂不同组织中的表达特异性，即该3个基因均在毒腺中特异性表达，其表达产物可被分泌至毒液中；同时分析了该3个基因在雌成蜂毒腺中表达随其发育的动态变化。第五，明确了PpSPN2和PpSPI的生物学功能，即均可抑制蝶蛹金小蜂寄主菜粉蝶血淋巴中的原酚氧化酶激活级联反应，但对寄主血淋巴中PO活性的影响不显著。第六，明确PpSPN2能够与寄主菜粉蝶血淋巴中的原酚氧化酶激活蛋白PrPAP1，及其血淋巴蛋白PrHP8发生相互作用。上述结果表明，蝶蛹金小蜂毒液中存在丝氨酸蛋白酶抑制因子，其能通过与寄主菜粉蝶血淋巴中特定的丝氨酸蛋白酶发生相互作用，从而抑制其活性，最终来抑制寄主体液免疫反应中的血淋巴黑化过程。本项目所获得的研究成果，一方面可为进一步深入揭示寄生蜂毒液组成与功能，以及昆虫先天免疫反应的过程与机理提供新理论与新方法；另一方面也可为建立以害虫先天免疫系统为靶标的新型杀虫剂－免疫抑制剂的先导化合物高通量筛选平台，以及基于抑制先天免疫反应的新型害虫生物防治策略的研究奠定理论基础与方法支撑。最终为我国“绿色农业”生产与可持续发展提供害虫控制的新策略与新途径。