DNA分子机器信号放大机制及其抗生素残留检测研究

The powerful tool to maintain the quality safety of animal derived food is to develop quick method for the screening of antibiotics residue. Very recently, the newly method based on aptamer recognition is bearing many advantage including high selectivity and no expensive instrument is needed. Highly sensitivity detection will achieved through combining aptamer and signal amplification. However, the efficiency of present nuclear acid isothermal amplification depends on the diffusion of DNA strands, which resulted in a time-consuming incubation. Thus, such drawback doesn’t meet the requirement of quick screening. In this project, Signal amplification with assisting of DNA molecular machine is developed for the probe construction, which integrate target recognition with signal amplification. Based on the specific interaction between aptamer and target, the active DNA molecular machine will move along the surface of nanoparticles. Furthermore, signal amplification with quick reaction rate will obtained through study the mechanism of that drive by different power. In this study, an ultrasensitive method is developed for the detection of animal derived antibiotics residue, such as Kanamycin etc. Moreover, this study could offer technology and theory support for the quick screening of antibiotics residue in food. At the same time, it is also beneficial for quick, sensitive, and specific detection of other small molecules.

抗生素残留的快速筛查是保障动物源性食品质量安全的重要手段之一。近年来，基于核酸适配体识别技术的抗生素检测方法因选择性好，无需依赖大型仪器等优点广受关注。将适配体与信号放大技术相结合，能够获得更高的检测灵敏度。然而，常用的均相核酸恒温扩增过程中，反应链自由扩散导致信号放大耗时较长，无法满足快速检测的需要。申请者拟发展基于DNA分子机器辅助的信号放大技术，构建“目标识别-信号放大”一体化探针。通过核酸适配体与目标间的特异性结合，“激活”DNA分子机器在纳米颗粒表面运动，并在此基础上，研究不同驱动力作用下，DNA分子机器的信号放大机制，发展具有高反应速率的信号放大技术。同时将以卡那霉素等动物源性抗生素残留作为研究对象，探索建立超灵敏快速检测抗生素残留的新方法。项目研究将为食品中抗生素残留的快速筛查提供技术理论支撑，同时也为其他小分子的快速、灵敏、特异性检测提供新思路。

抗生素残留的快速筛查是保障动物源性食品质量安全的重要手段之一。近年来，基于核酸适配体识别技术的抗生素检测方法因选择性好，无需依赖大型仪器等优点广受关注。将适配体与信号放大技术相结合，能够获得更高的检测灵敏度。然而，常用的均相核酸恒温扩增过程中，反应链的自由扩散过程导致信号放大耗时较长，无法满足快速检测的需要。项目以氨基糖苷类抗生素卡那霉素为研究对象，首先，利用适配体调控金纳米颗粒和荧光银纳米簇之间的表面等离子增强能量转移，建立了卡那霉素荧光检测方法。提出基于目标诱导的催化发卡组装制备Y型DNA模板用于荧光铜纳米颗粒的原位合成。利用所形成Y型DNA结构的3’端突出，无法被核酸外切酶Ⅲ降解，从而利用酶切作用有效降低信号放大策略中背景信号。通过调控目标对催化组装体系中引发链的作用，实现了对目标核酸及凝血酶的定量检测。进一步，基于三维DNA分子机器辅助的信号放大技术，构建了“目标识别-信号放大”一体化探针，在同一界面上实现目标识别-信号放大-信号输出功能的高度集成。同时，三维DNA分子机器运动界面上较高的底物链局部浓度，提高了酶催化反应速率速率，大大缩短了检测耗时。在基于酶驱动的DNA分子机器模式下，所构建的一体化探针在40min内实现低至1.23 pM卡那霉素的定量检测。为突破单一颗粒上底物载量限制，将不同纳米颗粒界面上DNA分子机器耦合，利用上游DNA分子机器运动切割的产物“激活”下游DNA分子机器运动，构筑了级联DNA机器信号放大体系，在60 min内实现低至28 fM卡那霉素的超灵敏检测。另一方面，在基于DNAzyme驱动的DNA分子机器模式下，利用硫代胆碱还原二氧化锰纳米片释放出的Mn2+，构建了自驱动型DNA分子机器一体化探针，并用于有机磷农药的灵敏检测。在此基础上，通过驻点介导的链置换反应，将催化发卡组装信号放大体系与DNAzyme驱动的一体化探针耦合，构筑了无酶级联信号放大体系，并通过同步荧光技术实现卡那霉素的比率荧光检测，有效克服环境因素对检测结果的影响。以上项目研究成果为基于适配体的界面识别与信号放大技术的高效耦合提供了有效的构建策略，同时也为食品中抗生素残留的快速、灵敏、特异性检测提供技术支撑。