基于新型氨基酸离子液体中酶促合成糖苷类化合物的分子机理研究

Biomacromolecule-ionic liquid interactions have been the current subject of intensive studies. Based on the previous studies, the new-type amino acid ionic liquids (ILs) with physicochemical properties of atom economy, enzyme-biocompatibility, biodegradablity, renewability, high solubility toward substrate, and ability of improving or keeping enzyme activity will be obtained through rational design, synthesis and screening process. The β-glycosidase-mediated glycosylations in various ILs will be systematically characterized to illustrate the effects of the unique nature of the ILs on the reaction rate, product yied, selectivity, and enzyme stability as well. By combining the dynamic characteristic parameters of enzymatic glycosylation, ILs features, and the protein structure change identified using the circular dichroism, fluorescence, infrared spectra, and NMR spectra techniques, the molecular mechanism of the β-glycosidase-mediated glycosylation in ILs will be revealed. Finally, on the basis of above research work, an efficient and highly selective enzymatic glycosylation will be established. The research on some novel informations between the ILs and the enzyme structure in this project not only is beneficial to instruct the green ILs synthesis, but also will provide evidences for the modificaton of enzyme molecule and enrich the fundamentals of enzymology.

离子液体与生物大分子的相互作用关系是当前的研究热点。基于前期研究基础，理性设计并合成原子经济、酶相容性好、易生物降解、可再生的，对底物具有较高溶解度，可提高或稳定酶活性的新型氨基酸阳离子/阴离子型离子液体；对比研究不同离子液体中酶促糖基化反应的特性，阐明离子液体结构、组成及性质对反应速度、产率、选择性及酶稳定性的影响规律；借助圆二色光谱、荧光光谱、红外光谱和核磁共振谱仪分析技术，探究不同氨基酸型离子液体中β-葡萄糖苷酶蛋白分子的二、三级结构变化，并结合离子液体的理化性质及酶促反应的动力学特征，揭示其影响β-葡萄糖苷酶分子催化特性的分子机理；在此基础上，建立绿色、高效的糖苷化合物生物合成体系。本研究将为可用于高效生物催化反应的新型绿色离子液体的设计提供科学指导；含不同离子液体介质中酶构效关系的信息，也将成为高效、高选择性新酶分子修饰和改造的依据，有助于进一步深化对酶学基础理论问题的认识。

糖苷类化合物是一类广泛存在于生物体内，具有多种生物活性和药理功能的次级代谢产物，在食品、药品及化妆品领域中有着重要的应用。与天然提取、组织培养或化学合成等传统方法相比，酶法合成糖苷类化合物因酶来源广泛，选择性高，无需繁琐的保护/去保护步骤、产物易分离纯化及反应条件温和等优势已逐渐成为糖苷合成的首选方法。. 近年来，作为传统有机溶剂替代者的离子液体逐渐被人们所认识，并在生物催化领域显示出巨大的应用潜力。离子液体与生物大分子的相互作用关系也成为了当前的研究热点。本研究筛选了23种植物源糖苷酶，发现黑布林籽β-葡萄糖苷酶催化糖苷类化合物合成的活性最高，达27.6 U/g；并通过对比研究17种新型胆碱-氨基酸、14种常用咪唑型离子液体-有机溶剂混合体系中酶促糖基化反应的特性，阐明了离子液体结构、组成及性质对反应速度、产率、选择性及酶稳定性的影响规律；经优化，在1,4-二氧六环-C6MIm•BF4（1.0%，v/v）-磷酸缓冲体系中，酶促合成红景天苷的初速度和产率高达3.3 mM/h和24.5%。此外，以不同结构的烷基醇和芳基醇为受体研究酶促糖基化过程中的底物识别规律时发现，β-葡萄糖苷酶可催化5种烷基糖苷及8种芳基糖苷的合成，显示出该酶良好的底物谱，且酶促反应的初速度和糖苷产率取决于醇基的结构特征。. 以黑布林籽β-葡萄糖苷酶电泳纯蛋白为基础，借助圆二色光谱技术，分析了17种氨基酸型及9种咪唑型离子液体中β-葡萄糖苷酶蛋白二级结构的变化，发现α-螺旋和β-折叠含量分别呈现降低和增加的趋势，这表明酶蛋白结构出现了解折叠和伸展的现象，柔性增加。同时，研究还发现离子液体的阴阳离子均是影响蛋白结构变化的重要因素，这为揭示离子液体影响糖苷酶分子催化特性机理提供了证据。. 本研究不仅为可用于高效生物催化的新型绿色离子液体的设计提供了科学指导，含不同离子液体介质中酶构效关系的信息，也将成为高效、高选择性新酶分子修饰和改造的依据，进一步深化了对酶学基础理论问题的认识。