p15和p16基因甲基化介导肝癌甲胎蛋白上调的机制研究

甲胎蛋白(AFP)作为肝癌诊断、预后及疗效评估的重要标记物,但其在肝癌中上调机制尚不清楚。我们前期研究结果提示，p15和p16基因DNA甲基化可能参与肝癌AFP表达上调,但确切分子机制尚不明确。本课题将在前期研究成果基础之上,首先在肝癌细胞和组织中，观察DNA甲基化转移酶（Dnmts）、p15和p16基因表达，检测p16、p15基因甲基化，并分析它们与AFP的相互关系；观察Dnmts抑制后在肝癌细胞系及裸鼠肝癌诱癌模型中对p15和p16基因去甲基化作用及对AFP蛋白表达和肿瘤细胞生长的影响；针对不同AFP表达水平肝癌细胞株,采用RNA干扰技术、基因重组技术，观察Dnmts、p16及p15表达或抑制后对肝癌细胞AFP表达和生物学的影响；最后结合临床，在肝癌组织中加以证实。预期研究结果可望能阐明Dnmts参与p15和p16基因甲基化上调AFP表达的分子机制，并为肝癌的诊治研究提供新的靶点。

肝癌是世界上许多国家的高发肿瘤之一，紊乱的表观遗传学机制导致基因功能和细胞增殖的异常，DNA甲基化现象伴随着肿瘤的发生发展全过程。基因组整体去甲基化和CpG岛区域性高甲基化是HCC进展中的常见现象。特异性位点高甲基化可能会特异性沉默相关基因的表达。前期研究发现，少数HCC病例显示多基因共同甲基化，定义为CIMP（+）肿瘤，此类患者表现为差的预后，高AFP表达及端粒酶高表达活性。大量证据表明，肝癌的转移与复发与肝癌干细胞紧密相关，我们选择肝癌干细胞相关细胞，如AFP+、CD133+、及端粒酶（+）细胞，分析相关基因甲基化对干细胞的影响。本课题证实，Line-1去甲基化与肝癌的高死亡率相关，且与CD133的高表达密切相关。5-氮杂胞苷处理的肝癌细胞呈现端粒酶活性减低，伴随着hTERT下调。检测发现，7721细胞系中hTERT基因启动子区的高甲基化状态向去甲基化发生逆转，并且与5-氮杂胞苷的处理呈时间和浓度线性关系；但是HepG2细胞中hTERT基因启动子区呈部分甲基化修饰，在高浓度长时间5-氮杂胞苷处理之后，呈现完全未甲基化状态。同时，各细胞系中hTERT转录抑制因子p16基因启动子区发生去甲基化而重新激活，hTERT转录活化因子c-Myc在细胞系中表达均被抑制。这些结果提示，5-氮杂胞苷对肝癌细胞端粒酶活性的抑制作用，很可能是p16基因重新激活、c-Myc基因表达抑制及hTERT去甲基化共同作用的结果。更重要的是5-氮杂胞苷可以增强肝癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性，增强肿瘤细胞的凋亡。肝细胞癌甲胎蛋白高表达对肝癌预后不利，可能与肝脏祖细胞的激活状态有关。因此课题研究结果有助于认识相关干细胞特征及表达机制，有助于阐明肝癌干性细胞与表观遗传机制的调控关系，有可能成为肝癌治疗的靶点之一。