小分子RNA对原始生殖细胞定向分化的信号调控的研究

性别决定和发育机制是一个多基因调控的复杂的分化事件，其分子作用机制极其多样化。microRNA参与生命过程中一系列的重要进程，是重要的非编码调节因子，其靶基因是转录因子或与个体发育和信号转导有关的调控蛋白的编码基因。本研究通过分离扩增培养原始生殖细胞，体外诱导获得定向分化配子细胞。利用microRNA芯片分析比较相互microRNA谱系，对鉴定其调控的靶基因表达和功能。揭示生殖细胞性别决定分化特异性表达的microRNA确切位点、准确的时间和作用的靶点。在不同的环境作用下，microRNA的作用靶点的变化机理,转录因子调控的microRNA分子调控网络的机制。

生命体性别决定与分化是由一系列复杂的转录因子和信号传导因子构成的协同作用通路。 microRNA参与生命过程中一系列的重要进程，是重要的非编码调节因子，其靶基因是转录因子或与个体发育和信号转导有关的调控蛋白的编码基因。MicroRNAs是生物体内非编码小RNA,能与靶mRNA的3‘端的非编码区序列互补结合而导致microRNA的降解或抑制其翻译，从而影响基因的表达。在不同物种中，人们已经发现数百个microRNA在不同组织、不同发育阶段中有显著表达水平上的差异并参与生命过程中一系列的重要进程。microRNA在表达上的时空特异性及其对转录后因子的调控,与发育及分化过程涉及一系列转录及转录后的基因表达密切相关。为研究microRNA在斑马鱼早期性分化过程中的表达,探讨microRNA在性腺早期发育中的作用,本研究筛选出的差异表达microRNA对功能及其调控的靶基因进行分析, 转录因子调控的microRNA分子调控网络的机制。主要取得的研究结果如下:.1. 在斑马鱼早期胚胎发育各个时间点，比较分析了性别决定基因的表达，初步得到了斑马鱼性别决定分化特异性表达相关基因在斑马鱼发育中表达图谱。通过对这些特异性基因的研究，为斑马鱼性别分化准确的时间点提供了潜在的依据，通过进一步研究相关基因的调控机制以加深生命进化过程的认识。.2.利用microRNA芯片分析比较相互microRNA谱系，鉴定其调控的靶基因表达和功能。mir-20、mir-126、mir-144、mir-150、mir-202和mir-223在斑马鱼精巢表达量明显高于卵巢。mir-21、mir-24、mir-29b和mir-15a在卵巢有较高的表达。尤其是mir-202和mir-15a分别在精巢和卵巢有这显著的差异性的高表达。.3.结合本研究结果及其它物种中相应microRNA的研究,筛选了3个microRNA（mir-202、mir-29b和mir-15a）可能参与早期斑马鱼性腺发育过程的microRNA作为下一步研究的对象。.4. 定点基因打靶转录激活子样效应因子核酸酶技术TALENs及CRISPR/Cas9能够定点地在细胞基因组上产生双链断裂实现基因靶向修饰和删除，已成为当前生物医学研究的热点。我们将利用TALENs和 CRISPR/Cas9技术，以实现斑马鱼性别决定基因的敲出，进而获得基因敲出斑马鱼，用