流体剪切应力单独或联合生长因子/基底硬度调控骨髓基质干细胞朝不同方向的分化及机制研究

The modulation of stem cells lineage specification is of vital to clinic and basic research.It has been proven that mechanical signals are potent regulators,however,the same type of mechanical stimulation existed in various tissues, for instance fluid shear stress (FSS) in bone,cartilage and blood vessels determines the fate of mesenchymal stem cells (MSCs) and its mechanism are unclear. We hypothesized that the differentiation of MSCs can be modulated by one type of mechanical force (here we focus on FSS), which was supported by our new find that the FSS with different increasing slopes regulated the differentiation of MSCs to osteogenic or chondrogenic cells. To obtain more FSS inducing the special lineage of MSCs for next mechanism study, we changed the magnitude, rate, increasing speed and duration of FSS, tested the markers for osteogenic, chondrogenic and adipogenic cells.The mechanosensitive, cation-selective channel, intracellular calcium response, F-actin, NMMII, lamin A,translocation of F-actin modulated proteins and transcription factors, gene and protein expression as well as signaling pathways were tested.Considering the coexistence of growth factors and matrix with mechanical stimulation in vivo, we intended to study the influences of FSS along with growth factor and matrix stiffness. Our research would add new insights of tools and machanism controlling the differentiation of MSCs.

干细胞分化的调控及机制对临床和基础研究有重大意义。已证明力学因素是有效的调节剂，然而存在于不同组织的同一种力刺激（如骨、软骨和血管中的流体剪应力（FSS））有效调控MSCs朝不同方向的分化和机制却不清楚。我们假设MSCs的分化方向受一种力刺激调控。在前期发现的不同增加速度的单向FSS促进MSCs骨或软骨向分化基础上，变化FSS大小、频率、方向、增加快慢、作用时间，测试骨/软骨/脂肪向分化标志，得到促进MSCs不同方向分化的FSS；从力敏感阳离子选择性通道、胞内钙、F-actin、NMMII、Lamin A、筛选受F-actin调控的蛋白和转录因子的构型和空间位置变化、基因和蛋白表达的变化和信号通路方面研究FSS调控MSCs不同方向分化机制；进而将FSS与共存于在体组织中的生长因子或不同硬度基底结合，更仿生地探讨MSCs的分化调控及机制。研究为揭示MSCs的分化调控手段和机制增添新内容。

干细胞分化的调控及机制对临床和基础研究有重大意义。已证明力学因素是有效的调节剂，然而存在于不同组织中的同一种力刺激（这里主要关注骨、软骨和血管中的流体剪应力，FSS）有效调控骨髓间充质干细胞（MSCs） 朝不同方向的分化和机制却不清楚。.在假设MSCs 的分化方向可受一种力刺激调控的基础上，发现了1) 20分钟不同增加速度的单向FSS 可促进MSCs的骨或软骨向分化，或者可同时促进MSCs的骨和软骨向分化。具体的实验设计和过程为，MSCs细胞受不同的FSS作用20分钟，其FSS由0 dyn/cm2 在0、0.5、1、2以及20分钟的时间段内，线性增加到10 dyn/cm2 ，然后维持10 dyn/cm2直到20分钟，分别表示为0-0’, 0-0.5’, 0-1’,0-2’和0-20’五种作用方式，五种方式的加载每秒力值的改变存在数量级的差异，作用时间相同，其中0-0’和0-0.5‘更接近生理水平，加载结束后静置培养48h进行下一步的检测。发现，0-0’促进MSCs的软骨向分化，0-2’促进它们的骨向分化，0-1’具有同时促进其骨和软骨向分化且促进作用最大。2）在机理上，不同增加速度的单向FSS 调控MSCs的骨或软骨向分化中，细胞内钙离子浓度，特别是从力学敏感型的钙离子通道进入细胞的钙离子浓度和细胞的F-actin组装都起到了重要作用。具体的，0-0’引起了中等程度的细胞内钙离子浓度增加和细胞的F-actin组装，而0-2’引起了最大程度的细胞内钙离子浓度增加和细胞的F-actin组装。而我们发现静态培养的原代骨、软骨以及MSCs细胞的细胞内钙离子浓度没有显著差异，而F-actin的强度则有显著不同，其中软骨细胞大于骨细胞，又大于MSCs细胞。同时我们发现，核膜蛋白LaminA作为核膜的重要成分也参与相关分化调控：LaminA调控了0-0、0-1加载方式引起的软骨向分化，而对于0-1、0-2所引起的成骨向分化没有影响。3) 对比了不同增加速度的单项FSS、基底硬度和MSCs的骨或软骨分化介质对MSCs分化的调控能力，发现20分钟的不同增加速度的单项FSS可抵抗2-3天的基底硬度和5天的分化液诱导，是一种有效的分化调控手段；4）研究了原位软骨细胞钙信号和胞外基质检测的实验和人工智能测试方法，氧分压对原位软骨细胞自发钙响应和基质分泌的影响及关联。