BmαTX14多肽与通道β亚基协同调节钠通道功能的机制研究

蝎毒肽特异性作用于钠通道，常被用于探测钠通道的结构与功能。目前，国际上偏重于研究蝎毒肽与钠通道α亚基相互作用，忽略了钠通道β亚基对二者相互作用的影响。课题组前期工作观测到一个重要发现：蝎毒肽BmαTX14延缓了钠通道Nav1.4的失活过程，但是当有钠通道β1亚基共表达时，BmαTX14多肽对钠通道失活过程的延缓作用更加明显。基于蝎毒肽BmαTX14与钠通道β1亚基对Nav1.4功能的协同调节特性，本项目拟以BmαTX14多肽为分子探针，在钠通道α亚基与不同组合β亚基共表达时，系统研究毒素多肽对钠通道功能调节的差异性。综合运用通道蛋白和毒素多肽的定点突变实验及蛋白质相互作用的计算机模拟，深入揭示BmαTX14多肽与β亚基协同调节钠通道的分子机制。这些工作的开展将在国际上率先从新视角（多肽-通道α亚基-β亚基相互作用的网络关系）有效地揭示钠通道的结构与功能关系，加速认识钠通道的病理生理意义。

国家自然科学青年基金项目（30900239）重点研究BmαTX14多肽与钠通道α亚基相互作用的分子机制，同时开展了BmαTX14与β亚基协同调节钠通道 α亚基的研究。.选用表达载体pET-28a，将测序正确的重组克隆转化至表达菌E.coli Rosetta(DE3)中。经IPTG诱导，通过超滤脱盐浓缩和RP-HPLC分离得到色谱纯的重组BmαTX14多肽。全细胞式膜片钳技术检测发现BmαTX14显著延缓Nav1.4通道的快速失活，但对Nav1.2通道的活性很弱，表现出典型的α-like毒素的活性。.对BmαTX14的13个丙氨酸扫描的突变体进行电生理研究表明，BmαTX14的活性表面主要由NC-domain和Core-domain两个结构域组成，NC-domain上的碱性氨基酸、Core-domain上的芳香族氨基酸和邻近的天冬酰胺是维持毒素活性的关键位点。以Nav1.2和Nav1.4两种通道的氨基酸序列差异为基础，构建了杂合通道，证实BmαTX14的这种药理学性质差异是由DIV S3-S4 loop的的天冬氨酸差异决定的。.构建了小鼠钠通道三种beta亚基的真核表达载体。研究表明当β1存在时，BmαTX14延缓Nav1.4通道的快速失活的活性提高3-5倍，而β2亚基使BmαTX14的活性下降3-5倍。进一步发现β1和β3能增强BmαTX14对Nav1.4的稳态失活的调节作用。Lqh2与BmαTX14类似，提示α-like毒素与β亚基轻微协同调节钠通道的功能具有普遍性。.对BmαTX14毒素多肽突变体进行活性扫描，发现BmαTX14-K62A和BmαTX14-T18R与钠通道β1亚基产生了明显的协同作用。对通道β1亚基和通道β2亚基进行片段交换，证明β1亚基与BmαTX14多肽的协同位点应该位于β1亚基细胞外段或跨膜段。.综上所述，本工作优化了BmαTX14多肽的表达方法为起点，并重新鉴定了其药理学活性。较系统地研究了BmαTX14与Nav1.4通道相互作用的分子机制。通过对BmαTX14及Lqh2两种毒素的研究证明α-like毒素与β亚基轻微协同调节钠通道的功能具有普遍性。