4CL基因调控柑橘类黄酮生物合成的机制研究

Citrus is one of the most important plants for fresh fruit and processing. It contains a large varieties of flavonoids and is a major source of dietary and medicinal flavonoids. Improvement of flavonoids content in citrus possess the great potential to increase the economic value of citrus industry. 4CL gene family encodes the enzyme of 4-Coumarate:Coenzyme A Ligase, a key enzyme to form the common substrate ρ-coumaroyl CoA at diverging point of phenylpropanoid pathway for the two branches of flavonoids and lignin biosynthetic pathways. The published reports indicated that the competition exists between the biosynthesis of flavonoids and lignin. The expression of 4CL genes is influenced by genetic background, the development of the plant and environmental factors. Our previous study identified there are three members of 4CL genes in the citrus. The class II gene Ci4CL2 is responsible for the flavonoids biosynthesis. .In this project, the characteristics of the promoters of 4CL genes will be analyzed to understand the regulation of the gene expression. The transcriptome sequencing and GWAS analysis of segregation population resequencing will be carried out to identify the transcription factors (TF) regulating the expression of 4CL genes. The various citrus germplasm and tissue types, and peels in fruit maturation period will be used to study the temporal and spatial expression profiles of the three 4CL genes and TFs, and the co-relationships with flavonoids and lignin contents. The silence and over expression of candidate TFs by gene transformation will be conducted to validate the TF and study the mechanisms controlling the expression of the 4CL genes. The yeast one-hybrid will be used to detect the interaction of TFs and 4CL genes. The study will unveil the mechanisms of 4CL on biosynthesis of flavonoids and the interaction between the biosynthesis of flavonoids and lignin. This will provide a solution to improve flavonoids production in citrus through adjusting the phenylpropanoid mebabolic flux between flavonoids and lignin biosynthesis by genetic manipulation of 4CL gene expression. The results of the study will be the important information for further study the genetic mechanisms of the flavonoids biosynthesis.

柑橘是全世界最重要的水果植物，含有多种成分的黄酮类化合物，是膳食和药用类黄酮的重要来源。目前对柑橘类黄酮生物合成的遗传调控机制尚缺乏研究，无法对类黄酮的含量进行定向遗传改良。4CL基因家族编码的4-香豆酸:辅酶A连接酶是苯丙烷代谢途径的两个重要分支——类黄酮和木质素生物合成上游的关键限速酶。已有研究表明，类黄酮和木质素的生物合成存在明显的竞争关系。本课题组在前期的研究中明确了柑橘有三个4CL家族基因，其中Ci4CL2是控制类黄酮生物合成的重要基因。在此基础上，本项目将通过对4CL基因的启动子结构特征、基因差异表达和分离群体GWAS等分析挖掘调控4CL基因的重要转录调控因子，通过转基因对表达调控模式进行验证。并对基因及转录因子的时空表达规律及其与类黄酮、木质素生物合成的关系进行分析,揭示两个生物合成途径之间的竞争机制，阐明通过调控4CL基因的表达对类黄酮的含量进行遗传改良的机理。

柑橘类黄酮能影响果实品质、植株抗逆性等，同时是膳食和药用类黄酮的重要来源，对人类健康具有重要作用。4CL家族基因位于苯丙烷合成途径下游的类黄酮和木质素生物合成途径的分支点，调控这两类生物合成。本研究的目的是挖掘并验证调控4CL的转录因子，以阐明4CL家族基因调控类黄酮和木质素生物合成，以及两个合成途径相互竞争的机制，为定向遗传改良提供理论基础。获得以下主要成果：a）CitMYB21负调控类黄酮的生物合成。CitMYB21的表达有显著的时空和种质特异性，与类黄酮含量的时空分布呈显著负相关，该转录因子可能是抑制柑橘类黄酮生物合成、决定其时空分布特异性的重要遗传因素；b）转录因子FcMYC2和CiMYB42可能调控类黄酮的生物合成。在研究其他柑橘次生代谢产物的遗传调控时发现FcMYC2和CiMYB42的表达明显与类黄酮的含量相关。其中FcMYC2与类黄酮和木质素的生物合成有较高的相关性。生物信息学分析显示该基因与4CL家族基因的启动子有较高的结合概率。.类黄酮是植物在进化过程中对光产生免疫响应的产物，CitMYB21在类黄酮含量极低的根中高表达，光照处理能提高根中类黄酮含量。因此，我们推测CitMYB21可能通过对光的响应调控类黄酮生物合成的时空分布，后续将以CitMYB21为切入点对类黄酮的生物合成机制进行深入研究。分析显示CitMYB21可能对苯丙烷代谢途径中的类黄酮、木质素、绿原酸等生物合成都有调控作用。初步代谢组分析显示，苯丙烷代谢途径的酚酸类等次生代谢产物在耐、感柑橘黄龙病（HLB）种质及其近源属中有显著的差异，这些物质具有一定的抑制微生物的作用，与抗病、抗逆等相关。我们推测次生代谢物的差异有可能与柑橘及其近源属物种对HLB的抗、感相关，通过定向遗传改良改变次生代谢物的产量和成分有可能使柑橘产生对HLB的抗性。FcMYC2可能对精油及类黄酮生物合成都具有调控作用，精油对HLB的传播媒介——木虱具有吸引作用。我们将分析精油缺失的转基因材料对木虱行为的影响，拟通过调控精油的含量或组成来使柑橘失去对木虱的吸引性，减少HLB的传播。以上设想已申请到了国家重点计划子课题《柑橘黄龙病致病机制与抗性种质创新》项目的支持。.在项目执行期间，发表了学术论文3篇，其中SCI收录1篇，EI收录2篇；培养了博士研究生3名，硕士研究生3名；晋升副高职称1名。