TEM8配体的鉴定和功能研究

肿瘤内皮标志物（tumor endothelial markers，TEMs）是一组在肿瘤血管内皮特异表达的基因，共有9种。其中TEM8是一个细胞膜蛋白，随后被鉴定是炭疽毒素保护性抗原（protection antigen，PA）的一种受体。除在肿瘤血管内皮特异性表达外，TEM8在发育中的胚胎组织的血管内皮也高表达，揭示TEM8在胚胎发育和肿瘤发生、发展过程中起着非常重要的作用。然而，到目前为止，TEM8的生理性配体是什么还不清楚。利用TEM8胞外区的亲和层析柱，我们在肝癌组织匀浆液中分离得到了一条分子量约50kDa的蛋白条带，质谱鉴定发现其中一种蛋白是尿激酶（urokinase-type plasminogen activator，uPA）。本研究拟通过相互作用验证、生物功能分析确定uPA是否是TEM8的一个生理性配体。在此基础上，进一步分析uPA和TEM8在肿瘤发生发展和转归中的作用。

肿瘤内皮标志物8（TEM8）是在肿瘤内皮特异性表达的一个细胞膜糖蛋白，研究表明它也是炭疽毒素保护性抗原的一个受体。但是，TEM8的生理性配体是什么目前还不清楚。本研究通过亲和层析和质谱分析的方法从人的肝癌组织匀浆液中鉴定出尿激酶是TEM8的一个相互作用蛋白。分析发现，TEM8胞外区结合尿激酶的能力与其结合炭疽毒素保护性抗原相当。进一步的研究发现，TEM8结合尿激酶的Kringle结构域和羧基端的低分子酶活性区，不结合其氨基端的EGF样结构域。这与尿激酶结合已知尿激酶受体不同。TEM8虽然与其酶活性区结合，但并不影响尿激酶的活性。在此基础上，我们构建了TEM8蛋白的胞外区与人IgG1抗体Fc片段的融合蛋白TEM8-Fc。通过Biacore和Fortebio两种技术，确定TEM8-Fc和尿激酶原、高分子尿激酶和低分子尿激酶的亲和常数分别是16.6 nM, 29.7 nM和31.1 nM。.尿激酶与TEM8结合剂量依赖性的增强TEM8的酪氨酸磷酸化水平。通过膜受体酪氨酸磷酸化组学芯片（该芯片能分析已知的71种酪氨酸激酶受体的磷酸化状态）分析，尿激酶还相对特异的增强表皮生长因子受体EGFR的磷酸化。TEM8-Fc预处理几乎完全封闭了尿激酶刺激的TEM8和EGFR受体磷酸化水平升高。最后，通过细胞学和动物实验证实，TEM8-Fc能显著封闭尿激酶诱导的肿瘤细胞迁移和裸鼠接种的人肿瘤的生长和转移。这些数据提供了充分的证据证实TEM8是尿激酶的另一个新的受体，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。也说明了捕获尿激酶是TEM8-Fc抗肿瘤效应的主要机理。此外，研究结果也在理论上阐明了尿激酶的许多不依赖已知尿激酶受体的生物学功能。