OECs-NT-3基因工程细胞联合NSCs自体移植对自身免疫性脑脊髓炎突触信号传导及髓鞘修复的影响

细胞移植治疗自身免疫性脑脊髓炎(EAE)促进神经修复是理想策略。我们前期研究证明：神经营养因子-3(NT-3)基因修饰的嗅鞘细胞(OECs)可以在EAE宿主内分泌持续恒定的内源性NT-3，且在髓鞘修复方面协同良好；OECs与神经干细胞(NSCs)联合培养可以促进NSCs的存活、迁徙及分化，利于突触连接形成；本研究应用基因工程技术，利用逆转录病毒介导NT-3基因转染自体OECs，构建具有生物活性的OECs-NT-3基因工程细胞，并与自体NSCs联合移植治疗EAE；通过移植细胞的在体示踪，研究移植细胞的迁徙方向、分化行为、趋化性及突触建立情况；通过对宿主模型的髓鞘及轴突的微观形态观察、皮层体感诱发电位、逆行示踪标记技术、流氏细胞术等方法，探索解决移植细胞在宿主环境中持续、稳定分泌NT-3及如何使移植细胞与在体细胞建立有效的突触联系和信号传导等EAE修复的关键问题,为治疗EAE提供新的思路。

一、研究背景：本研究用体外培养较高纯度的嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells ,OECs）应用基因工程技术，尝试利用逆转录病毒介导人NT-3 基因转染OECs，构建具有生物活性的OECs-NT-3 基因工程细胞，观察其对EAE的治疗作用并探讨其机制。.二、主要研究内容和方法：1.采用原代培养的方法，自人胚胎的嗅球培养出OEC。提取、纯化逆转录病毒载体PN2A-NT-3，建立PA317-NT-3细胞株。并构建OECs-NT-3基因工程细胞。2.测定OECs-NT-3基因工程细胞分泌的NT-3蛋白随时间变化的表达量；检测转染后细胞上清RNA是否相符及表达量；PC12-TrkC细胞共培养实验，对转染后的细胞行MTT细胞增殖实验，观察转染对其生存的影响。3.从形态学结构、神经纤维密度、神经电生理、运动功能学评分及超微结构等方面，基因工程细胞移植对EAE的髓鞘修复及轴突再生的作用。.三、结果：1.OECs-NT-3移植后，可在宿主环境内存活，广泛分布，不仅可以在病灶内迁徙，而且可以在病灶间多点迁徙。2.OECs-NT-3 移植组HRP标记的神经元数目及面积明显多于OECs 移植组。移植4周时， OECs转基因移植组突触素(SYN)抗体染色灰度值显著高于OECs移植组及对照组，提示移植组的神经突触的生长数目明显高于其它组，有利于损伤神经突触的修复，促进神经冲动的传递。3.移植基因工程细胞28天后，单位面积内的神经纤维数目明显高于单纯OECs治疗组第；运动评分均明显高于单纯OECs治疗组。4.移植基因工程细胞4周后，转基因组组潜伏时间与正常相比无显著性差异（P>0.05）。.四、结论和意义：1.利用重组逆转录病毒构建OECs-NT-3 基因工程细胞可以稳定、持久地表达NT-3蛋白，在后代细胞中发挥作用。2.OECs-NT-3移植后，广泛分布，而且可以在灶间多点迁徙，脱髓鞘病灶对OECs的迁徙有趋化影响作用。3.移植基因工程细胞，能减轻神经元损害、促进脊髓轴突的再生；增加神经元数目和面积，利于损伤神经突触的再生。形态学及电生理研究证实，可显著促进髓鞘再生，提高神经传导速度。4.基因修饰的OECs分泌持续、足量的NT-3，起到很好的协同作用，治疗EA效果优于单独移植OECs。5.我们的工作为下一步自体移植的实现做了有益的尝试和先期准备