肠道选择压力对植物乳杆菌遗传稳定性的影响研究

The genetic stability is closely related to the production and probiotic properties of beneficial microbes. The intestine is the main target for probiotic, and the impacts of intestinal selective pressure derived by microbial interaction on genetic stability of probiotic are significantly. In present study, the rat intestinal model was used to estimate the impacts of intestinal selective pressure on Lactobacillus plantarum HNU082 isolated from the traditional fermented foods in Hainnan province. Based on the comparative genomics concept, we applied the shotgun metagenomic sequencing technologie to reveal the genomic mutations of intestinal L. plantarum HNU082 in situ. Meanwhile, the whole genome resequencing approach was used to verify the mutations in L. plantarum HNU082 isolated from intestine, and the mutations were correlated to the bacteria potential probiotic properties. Present basic research will establish a feasible evaluation system for probiotic genetic stability in vivo. Accordingly, we were able to estimate the safety and probiotic properties of L. plantarum HNU082 in vivo in a more effective and objective way, which will at the same time bring a new view in the selection of excellent probiotic in gut.

益生菌的遗传稳定性关乎菌株的生产及益生特性。机体肠道是有益微生物发挥益生功效的主要靶点，而肠道微生物相互作用衍生的选择压力会对菌株的遗传稳定性造成影响。本研究以分离自海南传统发酵食品中的有益微生物Lactobacillus plantarum HNU082为研究对象，通过给试验大鼠灌喂该菌株，完成不同时间点肠内容物的采集。联合使用宏基因组深度测序技术和基因组重测序技术，对菌株在肠道内基因组的遗传变异进行原位注释，同时对肠内该菌株的体外分离株进行基因组重测序、表型及益生特性研究。在精确绘制肠道内该菌株基因组遗传变异图谱的基础上，进一步探索突变位点与其表型及益生特性的潜在关联。本研究在建立完善益生菌体内遗传变异规律研究方法的基础上，能够更加客观准确的揭示肠道内菌株益生特性的稳定作用机制，并为以肠道为靶点的高效定殖株和优秀突变株的筛选获得提供全新思路。

对于肠道环境中菌株遗传稳定性的研究既关乎菌株的安全性评价，又直接影响其益生性能的稳定发挥，同时也为更加优秀突变个体及高效定殖株的筛选获得提供了新思路。为阐明肠道选择压力对益生菌遗传稳定性的影响，本研究从肠道微生态系统角度出发，以分离自海南传统发酵食品的一株具有潜在益生功效的有益微生物植物乳杆菌HNU082为研究对象，借助人，C57小鼠和斑马鱼三种典型生物学模型研究宿主肠道选择压力对菌株遗传稳定性的影响。并联合宏基因组测序与基因组重测序技术明确肠道内植物乳杆菌HNU082基因组的突变信息，在精确绘制肠道内该菌株基因组遗传变异图谱的基础上，找到突变位点与其表型及益生特性的潜在关联，探索肠道内该菌株的适应性进化及其与本地菌群的协同进化机制。首先我们建立了基于菌株水平宿主肠道内植物乳杆菌HNU082的分离方法，通过传统培养方法联合基因组学技术筛选获得了不同模型宿主不同时间点的子代分离株，解析了菌株发生的适应性突变。由该菌株的基因组遗传变异图谱，我们发现植物乳杆菌HNU082在不同模型中发生突变的频率与菌株在宿主体内定殖时间相关，与宿主模型的选择相关性较小，且在不同宿主间采用的是平行进化策略，分别由5个与碳水化合物利用和转座酶相关的平行进化基因驱动。经表型验证，我们发现短暂的肠道定殖促使菌株发生适应性突变，提升了菌株在宿主体内适应性，表型上体现在突变株对鼠李糖的利用增强，耐酸性增强。研究最后揭示了宿主本地菌群对益生菌干预的应答和共进化情况。益生菌的干预对小鼠肠道菌群的影响远大于对人肠道菌群的影响，并引发了本地菌群共进化，小鼠肠道本地菌群的共进化突变数量远高于人肠道菌群，以拟杆菌属和双歧杆菌属为主的肠道竞争者在益生菌定殖期间与益生菌争夺生态位，并出现了大量排他性突变，说明进化过程中物种不仅要适应环境，还要适应其他物种，揭示了肠道菌群进化过程中的“红皇后”假说。本研究阐释了益生菌进入肠道后的进化情况并探索了肠道内的协同进化机制，为以肠道为靶点的更加优秀突变株的筛选获得提供了全新思路。