EpCAM对肠上皮细胞间连接和细胞极性的调控机制研究

EpCAM (CD326, also known as Tacstd1), a type I transmembrane glycoprotein that is highly expressed in many rapidly growing tumors of epithelial origin, embryonic and somatic stem cells is implicated in various biological events. We have generated EpCAM global knockout mouse models, and have found that the structure and function of tight junctions in the intestinal epithelium of EpCAM mutant mice impaired significantly. We plan to study the molecular mechanism of EpCAM in regulating the junctions and polarity of the intestinal epithelium using EpCAM condational knockout mouse models. This research will contribute to understanding the detailed mechanism of EpCAM in maintaining the homeostasis of epithelial tissues, and it will also provide guidance for prevention and treatment of many types of cancers and other diseases.

上皮细胞连接分子EpCAM是肿瘤生物学和干细胞生物学研究的热点，已被证明具有多种生物学功能。申请者发现，在敲除EpCAM基因的条件下，新生小鼠肠上皮细胞间的紧密连接结构和功能受到明显影响，出生后10天内死亡。因此，EpCAM基因对成年鼠肠上皮细胞间各种连接结构（紧密连接、粘附连接、桥粒连接等）的作用尚不知晓。上皮细胞的极性对细胞间连接具有依赖性已成共识。EpCAM可能通过调节肠细胞间连接来影响肠细胞极性，进而维持肠上皮组织的稳定性。本项目拟制作条件性EpCAM基因打靶小鼠，通过分别与Rosa26-Cre ERT2或Villin-Cre ERT2小鼠杂交在成年小鼠的全身或肠上皮组织中特异性敲除EpCAM基因，分析EpCAM与肠上皮细胞间各种细胞连接分子的作用关系及EpCAM对肠上皮细胞极性的调节作用。为EpCAM在干细胞和多种上皮组织起源的肿瘤组织中的作用机制的研究提供重要参考。

EpCAM（上皮细胞连接分子）基因在多种上皮组织中表达，该基因功能缺失突变的纯合子会发生先天性簇绒肠病（CTE），患者从出生当天起就严重腹泻，病理检测发现肠上皮细胞排列紊乱导致肠绒毛簇集。前期研究发现EpCAM基因敲除小鼠的肠上皮组织细胞间的紧密连接结构受损，解释了CTE腹泻的分子机制，但导致肠绒毛簇集的原因仍不清楚。同时，EpCAM在多种干细胞和肿瘤组织（如结肠腺癌、肝细胞肝癌等）中都有很高的表达，但其在这些组织中的生物学功能并不清楚。为了深入探讨EpCAM在肠道和肝脏等组织的发育、生理及病理过程中的作用及机制，本项目利用CRISPR/Cas9技术制作了EpCAM基因敲除小鼠模型，同时利用AAV病毒载体制作了肝脏特异性过表达EpCAM基因的小鼠模型，通过形态学与组织学、生化检验、免疫染色、Western blot和qPCR等技术对这两种小鼠模型的肠道和肝脏进行分析。EpCAM基因敲除小鼠的肠绒毛出现明显的簇集，出生当天就严重腹泻，体重不增长。P4期小鼠的十二指肠和空肠有明显的炎症细胞浸润，肠上皮细胞发生炎性坏死。肠上皮组织细胞间紧密连接结构的主要构成分子Claudins家族在蛋白水平上表达量明显减少且在细胞上的定位发生紊乱。粘附连接和桥粒连接结构的主要构成分子在mRNA和蛋白水平上均出现明显升高。肠上皮组织极性相关的蛋白表达量降低。EpCAM基因敲除小鼠肝脏中Wnt信号通路的靶基因Axin2表达量降低，而肝卵圆细胞的标志性基因CD34表达量升高，表明肝脏的发育受到一定程度的影响。同时，EpCAM基因敲除小鼠的肝脏中糖原含量有所减少，参与糖原合成的UGP2基因表达量降低。成年小鼠肝脏过表达EpCAM基因后能明显加快胆汁淤积型肝纤维化的进程。这些结果解析了EpCAM基因在肠道和肝脏生理与病理过程中的分子生物学功能，为多种肠道和肝脏疾病的防治提供理论指导和药物筛选工具。