甜瓜N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶III基因的克隆及耐盐性调控机制研究

N-acetylglucosaminyltransferase plays a key role in asparagine connection type (N-) sugar chain synthesis. Under stresses conditions, it can quickly increase oxygen connection β-N-acetylglucosamine modification. When blocking or reduce this kind of modification, cells are more sensitive to stress. We used haploid type relation analysis to explore functional molecular markers and discovered melon N-acetylglucosaminyltransferase III gene. The regulation mechanism of this gene for melon under salt stress is still unclear. In order to study the function of this gene and to develop its breeding value, we will clone N-acetylglucosaminyltransferase III gene from melon for genetic transformation. This research will lay a good technical foundation for future melon breeding work.

N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶是一组与糖蛋白天冬酰胺连接型 (N-) 糖链合成有关的重要酶。在各种压力胁迫条件下，能快速增加核胞质蛋白的氧连接型β-N-乙酰氨基葡萄糖修饰。当阻断或减少这种翻译后修饰时，细胞对胁迫更加敏感。本项目组利用单倍型关联分析发掘甜瓜相关基因功能性分子标记，通过基因功能注释，得到N-acetylglucosaminyltransferase III基因。目前对该基因对甜瓜盐胁迫的调节机制还不清楚。为了研究该基因的功能以及开发它的育种价值，本研究拟通过细胞工程和基因工程操作技术，对甜瓜的N-acetylglucosaminyltransferase III基因进行克隆和验证分析，为甜瓜分子育种等相关工作奠定良好的技术基础。

为了探究盐胁迫下甜瓜N–乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因（CmGnT）的作用机制，根据甜瓜cDNA序列设计引物，利用RT-PCR技术克隆得到CmGnT。生物信息学分析表明，CmGnT的cDNA全长为2 193bp，开放阅读框（ORF）为1179 bp，编码 392 个氨基酸。CmGnT蛋白分子量约为46kD，理论等电点（pI）为7.93。蛋白结构分析表明，CmGnT含有β–1,4–N–乙酰氨基葡萄糖转移酶结构域，属于糖基转移酶 17 家族。该基因编码的蛋白有 1 个强的跨膜螺旋结构。进化树分析表明，CmGnT 氨基酸序列与黄瓜CsGnT（登录号：XP_004135275.1）亲缘关系最近，同源性为99.74%，与西瓜CsGnT的同源性为97.70%。实时荧光定量PCR分析结果表明，在NaCl、PEG、H2O2和ABA等非生物胁迫下的甜瓜叶片中CmGnT都显著上调表达，表明CmGnT受非生物胁迫诱导。分别构建了该基因过表达载体，RNAi表达载体以及Crisper-Cas9敲除载体，通过农杆菌介导进行甜瓜遗传转化，均得到了甜瓜阳性转化苗。盐胁迫下，与野生型相比，Crispr-Cas9敲除转化苗叶片的净光合速率值（Pn）、SPAD值以及抗氧化酶（POD、CAT、SOD）活性有所下降，过表达植株叶片的净光合速率值（Pn）、SPAD值以及抗氧化酶（POD、CAT、SOD）活性均有所升高，表明CmGnT基因在响应盐胁迫过程中起到重要作用。