糖皮质激素调控角质形成细胞表达Th1/Th2趋化因子相关信号转导通路的机制研究

Previous reports have shown that the expressions of Th1-type and Th2-type chemokines are elevated in the lesions and sera of bullou pemphigoid (BP). Keratinocytes (KC) are the main sources of Th1-type and Th2-type chemokines.Topical glucocorticosteroid therapy has become first-line treatment for BP in British Association of Dermatologists' guidelines for the management of bullous pemphigoid 2012. However, the therapeutic mechanisms of topical steroids are not fully known, especially the mechanisms of steroids' regulations on the Th1-type and Th2-type chemokines-expressions-related signal pathways in KCs. In the present study, using in vitro cultured prmiary human epidermal KCs, ELISA, real-time PCR, immunoblotting, immunofluorescence, immunoprecipitation, we plan to investigate the regulating effects of steroids on the Th1-type and Th2-type cytokines-induced expressions or secretions of Th1-type and Th2-type chemokines in KCs, and the regulating effects of steroids on the signals of three related signal pathways: TRAFs, MAPKs, NF-kB, AP-1 of the TNF pathway, JAKs, STATs of the interleukin and IFN pathway, and Smads of the TGF-b pathway. We try to uncover the therapeutic mechanism of steroids for BP and explore new targets for treating BP.

Th1、Th2型趋化因子在大疱性类天疱疮(BP)皮损和血清中表达升高。角质形成细胞（KC）是Th1、Th2型趋化因子的主要来源。外用糖皮质激素在英国已成为BP的一线疗法，但其治疗机制尤其是对KC表达Th1、Th2型趋化因子相关的信号转导通路的调控机制尚未阐明。我们拟采用原代KC体外培养、实时PCR、免疫印迹、免疫荧光、免疫共沉淀等方法，研究激素对KC中相关信号转导通路的调控机制：TNF通路的胞浆转导分子TRAFs、MAPKs，转录因子NF-kB、AP-1；白介素及IFN通路的胞浆转导分子JAKs、STATs，转录因子STATs；TGF-b通路的胞浆转导分子普通Smads，转录因子受体特异性Smads。其结果将为阐述外用激素治疗BP的机制提供科学依据，为发现治疗BP的新靶点提供理论基础。

采用人角质形成细胞系HaCaT体外培养，用ELISA、实时PCR、免疫印迹等方法，研究地塞米松对Th1/2型细胞因子诱导的HaCaT细胞分泌及表达的1、2型趋化因子的调节，同时研究激素对以下信号转导通路的相关分子的表达：（1）TNF通路；（2）白介素IL及IFN通路；（3）TGF-b通路。. 用ELISA法检测IFN-g、TNF-a、IL-17A、IL-17C及联合刺激下HaCaT细胞分泌CXCL12、CXCL11、CCL22的水平，结果显示：CXCL12在各种刺激条件下分泌为阴性；CXCL11在10ng/ml的IFN-g、TNF-a及二者的联合刺激、及TNF-a与20ng/ml IL-17C联合刺激中，分泌明显升高，其中，以IFN-g与TNF-a联合刺激分泌最高；CCL22在TNF-a单独及分别与IFN-g、IL-17A、IL-17C联合刺激中分泌均明显升高，以TNF-a与IFN-g联合刺激升高最明显。应用Western Blot方法，HaCaT细胞在IFN-g和TNF-a联合刺激下，STAT3磷酸化明显增加，10ng/ml地塞米松对此未见明显抑制作用。用逆转录-实时定量PCR法检测TNF-a和IFN-g刺激的HaCaT细胞中CXCL12、CXCR4、CXCR7、NF-kB（p-50）的表达，结果显示：CXCL12在两种刺激下表达均有升高，CXCR4仅在TNF-a100ng/ml刺激下表达明显升高；CXCR7在以上刺激条件下表达均低于对照组；NF-kB p-50在100ng/ml的TNF-a和IFN-g刺激下表达明显升高。用免疫组化法，发现CXCL12及其受体CXCR4在寻常型银屑病皮损中表达明显升高，且CXCL12主要分布在角质形成细胞胞浆内。. 本研究发现，寻常型银屑病皮损中CXCL12和CXCR4表达显著升高，但HaCaT细胞不分泌CXCL12；IL-17A上调HaCaT细胞CXCL12表达，下调CXCR4表达；IL-17A上调HaCaT细胞STAT3抑制因子SOCS3表达，抑制STAT3磷酸化。