伪狂犬病毒lncRNA（CTO）对病毒复制和潜伏感染的调控作用研究

Establishing lifelong latent infection in peripheral nervous system is the major characteristic of alpha herpesviruses including human herpes simplex virus 1, and is also the key scientific question facing the virologist at present. In this study, regarding pseudorabies virus (PRV) as a model of alphaherpesviruses, we hypothesize that lncRNA-CTO is involved in the process of genome replication and latent infection, for the reason that the locus of CTO is near and overlapping with the replicative origin of genome-oriL. The temporal patterns and quantity of expression and biosynthesis of lncRNA-CTO will be studied via cell experiment in vitro and animal experiment in vivo. Then we will construct stable cell lines and recombinant viruses, for purpose of studying lncRNA’s effect on PRV’s replication. The virulence of knockdown recombinant virus on mouse will be measured. In addition, we will inoculate swine with knockdown recombinant virus, then detect the expression quantity of lncRNA-CTO during acute infection, latent infection and reactivation, measure the copy number of genome in trigeminal ganglia, titrate the excreted virus in ocular and nasal swabs, and analyze the distribution of PRV antigen in trigeminal ganglia by immunohistochemistry, with an objective to reveal the CTO’s effect on PRV’s latent infection. This study will elucidate the spatiotemporal expression and function of PRV’s lncRNA, clarify the mechanism of alphaherpesvirus latent infection in the aspect of lncRNA, and provide the theoretical basis for developing novel vaccine against PRV and identification of potential drug targets.

在外周神经系统建立终生性的潜伏感染是α疱疹病毒的主要生物学特征，但其机制尚不完全清楚。本课题以伪狂犬病毒（PRV）为材料，根据PRV的lncRNA-CTO与病毒复制原点oriL的位置关系，推测该lncRNA可能与病毒的复制和潜伏感染有关；进而通过磷酰基乙酸等药物处理、荧光定量PCR和Northern blot等，研究lncRNA的表达时序及生物合成情况；构建复制子、细胞系和重组病毒，研究lncRNA对病毒复制的影响；将敲低表达的重组病毒接种小鼠测定毒力；将突变株接种猪，检测急性感染期、潜伏感染期和再激活期lncRNA的表达差异、病毒基因组拷贝数变化、鼻和眼排毒规律，用免疫组化检测病毒在三叉神经节中的分布，以阐明lncRNA对病毒潜伏感染的影响。本课题将揭示PRV lncRNA的生成特点及其功能，从lncRNA的角度探索α疱疹病毒的潜伏感染机制，为新型疫苗的研制和药物靶标的发掘提供理论依据。

伪狂犬病毒（Psedorabies virus, PRV）是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的成员之一。每年该病毒的感染给世界生猪养殖业造成重大的经济损失。分析发现PRV基因组可能编码未知的lncRNA，且这些lncRNA可能在病毒的感染、复制、神经细胞侵入和潜伏感染等过程中发挥重要的功能。本项目用随机引物代替oligo-dT对RNA进行反转录，利用高通量测序技术对文库进行测序，结果表明在PRV感染宿主细胞的过程中，病毒自身除了能够编码lncRNA外，同时还能够引起宿主细胞lncRNA的表达。病毒编码的lncRNA在神经细胞中同样具有较高的表达丰度，而且在不同培养方式的神经细胞中，病毒编码的lncRNA的表达量也不同。部分病毒自身编码的lncRNA被siRNA干扰后显著性地促进病毒的复制。通过3’RACE和5’RACE实验了解到PRV Ea株长链非编码RNA CTO-S全长为267 bp，并通过Western blot验证其不具有编码多肽的能力。利用细菌人工染色体技术（BAC）构建CTO-S全长缺失重组病毒研究其生物学特性，发现CTO-S对PRV在PK-15中的增殖以及横向扩散无显著影响。小鼠实验表明CTO-S不影响PRV的毒力。仔猪实验表明PRV潜伏的猪三叉神经节样品中检测到CTO-S的表达，但在再激活期为检测到CTO-S的表达。在此基础上进一步研究CTO-S的作用机制及相关功能，应用lncRNA pull down联用质谱技术以及RNA免疫沉淀技术进行验证，发现CTO-S与Cytochrome b-c1 complex subunit 1、RNA binding protein相互作用。本项目从病毒与宿主相互作用入手，研究PRV的潜伏感染机制，为PRV的潜伏感染以及新型疫苗研发提供理论基础和新的思路。