中药抗缺血再灌注损伤的效应成分筛选与品质评价研究

缺氧缺血性心脑血管病已成为我国发病率、致残率和死亡率最高的疾病。及时恢复心脑组织血液供应是挽救心脑缺血患者的最佳办法，恢复血流灌注后又给心脑组织带来了缺血再灌注损伤（I/R）。减轻I/R损伤成为研究热点。研究表明中药对I/R有很好保护作用，由于中药成分复杂，因此亟需建立一种与生物活性直接相关模型从中药复杂体系中快速分离、鉴定具有抗I/R损伤活性成分的方法具有重要现实意义。薄层色谱-生物自显影技术是将色谱分离技术和原位活性测定有机结合的一种国际公认方法。本项目通过建立缺血再灌注损伤的两个重要环节-抑制黄嘌呤氧化酶和清除超氧阴离子的薄层色谱生物自显影方法，以对缺血再灌注损伤有疗效的瓜蒌等中药为对象，建立基于薄层色谱生物自显影技术，从中药中快速筛选、鉴定黄嘌呤氧化酶抑制剂和超氧阴离子清除剂的方法。本方法的建立将为中药活性成分的快速筛选及建立与药效相关的品质评价体系提供新思路和新的方法。

以黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂筛选体系为研究对象，对检测波长、薄层板种类、显色方式、酶浓度、显色剂浓度、活化时间、显色时间等实验参数进行了考察，测定了该方法的检测限，建立了标准曲线、同板精密度、异板精密度、板间重复性、日间重复性、准确度（即回收率）进行了测定，表明该筛选体系重复性、准确度和精密度良好。同时对部分典型化合物和提取物的黄嘌呤氧化酶抑制活性或超氧阴离子清除活性进行评价，结果与经典分光光度法的相关性达到了0.973，表明了本方法的可行性。. 经典分光光度法无法满足高通量筛选，为此建立黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂高通量96微孔板筛选方法，针对该方法，进行了反应条件的优化，其中包括检测波长选择、反应温度、pH、酶浓度、与底物浓度及反应时间和样品溶剂、反应终止剂的选择，并对该方法进行了方法学考察，包括标准曲线、日内和日间精密度、稳定性、准确度（即回收率）进行了测定，表明该筛选体系重复性、准确度和精密度良好。在部分典型化合物与提取物的筛选中，与经典分光光度法的相关性分别达到了0.991和0.994，表明了该新方法的可行性。并且，与经典分光光度法相比，大大提高了筛选通量，节约了样品与试剂。. 采用已建立的黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂的薄层色谱-生物自显影筛选体系的活性测定结果为导向，对双边瓜蒌、补骨脂、北沙参进行了化学成分研究，并对部分化合物进行了活性验证。从双边瓜蒌中分得了25个化合物，其中18个化合物为属内首分，2个新化合物，其中三个化合物具有明显的抑制黄嘌呤氧化酶活性，其中一个化合物进行了细胞活性验证，结果表明该化合物具有对缺血缺氧的心肌细胞有保护作用，并呈剂量依赖关系。从补骨脂的活性部位分得11个化合物，其中1个新化合物，1个属内首发。联合OPLC技术，从北沙参中分得7个化合物，其中5个化合物有活性。. 利用薄层色谱生物自显影技术对黄芪进行定性鉴别初步研究，通过研究发现现膜荚黄芪和蒙古黄芪在Rf值0.1至0.4之间，存在不同的化学成分。同时，采用该方法测定了北沙参中异欧前胡素的含量，并将结果与高效液相所测得结果进行比较，初步研究表明该方法可行。