羊毛硫细菌素bovicin HJ50自诱导分子机制研究

羊毛硫细菌素是一类由革兰氏阳性菌核糖体合成并经翻译后修饰的抗菌肽，因其具独特抗菌机制及不易引起抗药性而倍受关注。Bovicin HJ50是本实验室新分离的AII类羊毛硫细菌素，前期研究表明其通过双组份信号传导系统进行自调控生物合成，但其信号传导的第一步- - 自诱导的分子机制尚不清楚。作为诱导剂分子的bovicin HJ50本身呈N端线形C端球形结构，还含一个少见的分子内二硫键。通过"体内修饰，体外加工"的方法合成其结构突变体库能够为了解其分子中起诱导功能的关键结构、理解其诱导机制提供便利条件。作为接受信号的组氨酸激酶BovK蛋白经分析其N端感受区结构与大多数羊毛硫细菌素的有很大不同，无保守感受结构域，暗示其可能存在特殊的信号感受机制。本申请拟从上述两方面深入研究bovicin HJ50的自诱导分子机制，为全面理解羊毛硫细菌素生物合成规律、进而为理解微生物对外界信号的感受及识别机制奠定基础。

羊毛硫细菌素bovicin HJ50 是由牛链球菌Streptococcus bovis HJ50 产生具有抑菌活性的小肽。它可做为信号分子在细菌细胞外进行诱导，从而调控自身生物合成，这个过程是通过双组分系统 BovK/R 接受诱导信号来完成。bovicin HJ50 N端线形C端球形，与典型AII类羊毛硫细菌素不同，其C端除含两硫醚环，还有一特殊二硫键环，这非常少见。同时其信号感受蛋白组氨酸激酶BovK N端含有8个跨膜域，且未预测到含任何已知的胞外感受结构域。因此 bovicin HJ50 是如何识别并激活BovK传导信号，即bovicin HJ50自诱导机制迄今为止还未发现报道。本项目中，我们从信号分子和感受蛋白两方面鉴定了bovicin HJ50与BovK的互作机制。一方面，通过本实验室建立的半体外合成系统对bovicin HJ50 进行了丙氨酸扫描突变及重要氨基酸替换突变，并进行诱导实验，发现B环中的3个带电荷和2个疏水性氨基酸，及分子中的2个甘氨酸对其诱导活性发挥至关重要。圆二色谱分析暗示2个甘氨酸可能与bovicin HJ50 与细胞膜结合时构象改变相关。另一方面，将bovicin HJ50进行生物素标记后验证其与BovK互作，发现bovicin HJ50可以与BovK的N端感受区结合。通过对BovK蛋白N端丙氨酸突变发现，其N端胞外环上的带电荷氨基酸和第六跨膜域上疏水保守区对其与bovicin HJ50 互作非常关键。由此我们推测了bovicin HJ50与BovK通过电荷及疏水作用互作的模型。这是国际上首次证明羊毛硫细菌素是如何开启并激活感受蛋白而开启生物合成信号传导通路的，这对于深刻理解羊毛硫细菌素的生物合成规律、微生物对自身活性代谢产物或外界环境信号的适应及识别具有重要的意义。另外，本课题还通过基因组数据挖掘从猪链球菌及蜡状芽孢菌中发现并合成了有活性的新型羊毛硫细菌素suicin及cerecidin，发现它们的生物合成调控分别与致病性或感受态形成相关。本课题还对一株产nisin的乳酸乳球菌进行了全基因组测序，对其可能的调控机制进行了初步分析。通过本项目研究工作，在微生物领域主流国际期刊如JBC，AEM，JB等刊物上共发表研究SCI论文4篇，国内核心1篇，申请专利2项其中1项获授权，另4项专利获授权。培养研究生9名，其中2人已获硕士学位。