配受体复合物HJ24-SHP2解离顺序的单分子力谱研究

The dysfunction of SHP2 is associated with leukemia, diabetes and breast carcinoma. Aptamer HJ24 derived from in vitro selection experiments forms a parallel G-quadruplex structure, showing strong regulated inhibitory effect on SHP2 phosphatase activity. This program will elucidate sequential dissociation pathway of G‑quadruplex aptamer HJ24 from SHP2 protein based on single molecule force spectroscopy(SMFS). Through optimizing parameters of protein immobilazation and tip modification, we will establish platforms for investigating the melting dynamics of unimolecular G-quadruplex aptamer HJ24 and dissociation dynamics of HJ24-SHP2 complex using SMFS. Through searching for the connection between dynamic force spectrum for secondary structure melting of HJ24 and dissociation of HJ24-SHP2 complex, we will reveal the sequential dissociation pathway of the HJ24-SHP2 complex and the conformational change of HJ24 in this process, deepening the dissociation mechanism of HJ24-SHP2 complex at the single molecule level. The study will be very helpful in providing the theoretical basis for physiological application of HJ24 and screening of SHP2 inhibitors. The research strategy of the project will provide the way for investigating the interaction of long G-quadruplex and protein in vivo.

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2与白血病、糖尿病、乳腺癌等重大危害疾病均有密切联系。具有单分子聚四链体结构的核酸适配体HJ24，能够快速、可逆调控PTP磷酸酶活性。本项目拟采用基于原子力显微镜的单分子力谱测量技术建立HJ24-SHP2复合物解离力以及HJ24熔断力测量平台和两者的动力学测量系统，探明HJ24熔断机制与HJ24-SHP2解离机制。通过寻找二者的特征共性及内在联系，从单分子水平阐明HJ24-SHP2复合物的解离步骤和HJ24在此过程中的构象变化，深化HJ24-SHP2的解离机理，为HJ24的生理学应用以及SHP2蛋白抑制剂的筛选提供理论依据。该项目的研究策略也将为生命体中的长链G-四链体与蛋白相互作用的研究提供新思路。

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2功能障碍与癌症、代谢病白血病、自身免疫病的发生均有密切联系。其适配体HJ24具有单分子聚四链体结构，能够快速、可逆调控磷酸酶活性。本项目采用基于原子力显微镜的单分子力谱测量技术建立双标记的HJ24针尖固定策略，发现HJ24在水溶液中存在着直链与G4-DNA两种构型平衡,并且靶蛋白的引入，可促使HJ24 G4-DNA构型的增加与稳定；测定SHP2-HJ24复合物解离动力学谱与HJ24的熔断动力学谱。 HJ24二级结构熔断与HJ24-SHP2复合物的解离都是由两个能垒和一个中间态控制。HJ24熔断的解离常数2.22 s-1，21.89 s-1； HJ24-SHP2复合物的解离常数为106.11 s-1,437.02 s-1。HJ24-SHP2复合物的稳定性大于HJ24自身稳定性，其中钾离子对于HJ24-SHP2复合物的稳定作用主要是通过提高近程能垒来实现的。HJ24在SHP2-HJ24复合物解离的过程中逐渐解旋，并在最终解离前完成解旋。并且，使用连接分子（EGD,GD）共价修饰及采用GST标签蛋白直接修饰方案都能获得适于SMFS的蛋白基底。GST法具有更高的酶活与识别方向性。连接分子（EGD,GD）修饰基底降低了SHP2-HJ24的解离能垒。此外，HJ24在 K离子 浓度为12 mmol / L时，出现最大的氧化还原电流和散点状的G-四链体HOPG自吸附结构暗示HJ24在此条件下出现了新的构型。该项目的完成深化了HJ24-SHP2的解离机理，为HJ24的生理学应用以及SHP2蛋白抑制剂的筛选提供理论依据，并有助于揭示生命体中广泛存在G4-DNA的生理学活性及功能。