USP44基因启动子甲基化在食管癌恶性进展中的作用和机制研究

Recurrence and metastasis are the main reasons for poor efficacy and prognosis of esophageal cancer. Previous studies have indicated a critical role of abnormal methylation of genes in tumor development. In pilot study, we found that the USP44 promoter region was hyper-methylated in esophageal cancer, leading to decreased protein expression and poor prognosis. Overexpression of USP44 inhibited the proliferation, migration and invasion of esophageal cancer cells. Liquid phase mass spectrometry and co-IP experiments showed that USP44 binds to SENP2 protein, and knockdown of SENP2 reverses the inhibitory effect of USP44 on proliferation and invasion of esophageal cancer cells. Based on these results, we hypothesize that USP44 inhibits proliferation and metastasis of esophageal cancer by stabilizing SENP2 protein through deubiquitination. This project aims to screen the downstream targets and signal pathways of USP44 through mass spectrometry and gene microarray. In vivo and in vitro experiments will be conducted to clarify the effect of USP44 on downstream targets and signaling pathways through SENP2, and to examine the functions and molecular mechanisms of USP44 gene in the malignant progression of esophageal cancer. The methylation level of the promoter region of USP44 gene in various esophageal cancer tissues will be detected by pyrophosphate sequencing, to determine its prognostic value in patients with esophageal cancer. The purpose of this study is to provide a basis for finding new therapeutic targets for esophageal cancer.

复发转移是食管癌疗效及预后差的主要原因，已有研究表明基因的异常甲基化在肿瘤发生发展中起重要作用。我们前期发现USP44启动子区在食管癌中显著高甲基化并导致其蛋白表达降低，患者预后差；过表达USP44可以抑制食管癌细胞的增殖，迁移和侵袭；液相质谱和Co-IP实验发现USP44与SENP2蛋白结合，敲低SENP2可逆转USP44对食管癌细胞增殖和侵袭的抑制作用。因此，我们提出USP44通过去泛素化稳定SENP2蛋白进而抑制食管癌增殖和转移的假设。本项目拟在此基础上：通过质谱分析和基因芯片筛选USP44的下游靶点及信号通路；体内外实验明确USP44通过SENP2对下游靶点和信号通路的影响，阐明USP44基因在食管癌恶性进展中的功能及分子机制；并通过焦磷酸盐测序检测多样本食管癌组织中USP44基因启动子区甲基化水平，明确其在食管癌患者预后价值。拟通过本项目研究，为寻找食管癌治疗新靶点提供实验基础。

DNA甲基化改变在食管癌的发生发展过程中起重要调控作用，我们通过焦磷酸盐测序证实USP44启动子区甲基化在食管癌组织和细胞系中显著升高；qRT-PCR和Western Blot发现USP44在食管癌组织和细胞系中低表达。通过去甲基化药物5-Aza处理食管癌细胞后测序和qRT-PCR发现USP44启动子区高甲基化可介导其在食管癌中mRNA表达降低；接着构建USP44过表达质粒，瞬转KYSE30,EC109和KYSE520进行细胞功能实验，发现食管癌细胞过表达USP44，可使其增殖、迁移和侵袭能力显著减弱。而在细胞株KYSE180中敲低USP44，可明显促进细胞的增殖和转移能力。这一部分结果明确了USP44启动子高甲基化致其低表达促进食管癌增殖和转移生物学功能。. 液相质谱和Co-IP实验显示USP44与SENP2蛋白存在相互作用；USP44与SENP2共转染293T细胞，USP44增加SENP2蛋白表达，并呈剂量依赖性；在USP44过表达的食管癌细胞中，经MG132处理后SENP2蛋白明显增加，经放线菌酮处理后SENP2降解速度明显降低；泛素化实验发现过表达USP44可以降低SENP2的泛素化；以上实验结果揭示USP44通过去泛素化作用稳定SENP2。在过表达USP44的食管癌细胞系中,敲低SENP2可以逆转USP44对食管癌细胞增殖和侵袭的抑制作用；裸鼠皮下移植瘤和肺转移瘤模型证实了在体内过表达USP44明显抑制食管癌的生长和远处转移。. 为了在临床样本中验证并揭示USP44蛋白在食管癌中的预后预测价值，我们收集了182例食管癌的石蜡组织标本进行免疫组化实验，发现USP44蛋白高表达率为39.0%（71/182），USP44表达与浆膜侵犯、临床分期和复发等病理参数显著相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示USP44高表达组患者平均总生存时间（96.1月）显著长于低表达组（36.7月，P<0.001)；多变量Cox回归分析发现USP44蛋白高低表达是影响食管癌患者总生存的独立预后因素,而且是独立的保护因素（P<0.001，HR=0.331(0.218-0.503)）。. 综上所述，我们结果获得了USP44参与食管癌恶性进展的可靠证据，揭示了USP44蛋白在食管癌中的预后预测价值，对食管癌的分子分型和“个体化”治疗提供科学依据。