邻苯二甲酸二丁酯影响泄殖腔发育致雄性子鼠尿道下裂合并肛门直肠畸形的机制及干预研究

In previous works, we injected human chorionic gonadotropin (HCG) into pregnant rats in late pregnancy，which successfully reduced the incidence of hypospadias induced by di-n-butyl phthalate（DBP）. In addition, we found that part of the hypospadias male offspring were complicated by anorectal malformations(ARMs) and DBP exposure in early pregnancy can increase this malformation. The embryonic development of cloaca plays an important role in the formation of urogenital and anorectal system. On the basis of previous works, in this project, we intend to: ①establish DBP-induced rat models and study the development of cloaca in male rat offspring from gestational day(GD) 12 to 18 by histological observation; ②use the gene array to detect the cloaca of the male rat offspring on GD 18 and verify the differential genes, further validate these gene changes in genital tubercle, bladder and terminal rectum of the hypospadias male offspring complicated by ARMs on postnatal day（PND） 1. We will clarify the effects of DBP to signaling pathways of cloacal development; ③Further investigate whether use of HCG in early pregnancy can more effectively reduce the reproductive and developmental toxicity of DBP and study the mechanisms. This project will deepen our understandings of the toxicological mechanisms of DBP, and provide new clues to find the preventions and treatments, at the same time provide the exact basis that DBP can induce ARMs.

前期课题通过孕晚期补充人绒毛膜促性腺激素（HCG）降低了邻苯二甲酸二丁酯（DBP）致尿道下裂的发生率；同时发现部分尿道下裂雄性子鼠并发肛门直肠畸形（ARMs），且孕早期DBP染毒能增加这种合并畸形的发生。胚胎期泄殖腔发育对泌尿生殖系统和肛门直肠的形成起着重要作用。在此基础上，本研究拟：①建立DBP致畸大鼠模型，用病理学方法观察孕(GD)12-18天畸形雄性胎鼠泄殖腔的发育。②用基因芯片筛选GD18天畸形雄性胎鼠泄殖腔组织中异常表达基因并验证。在出生后1天的尿道下裂合并ARMs雄性子鼠生殖结节、膀胱和末端直肠组织中进一步检测这些基因的变化，探讨DBP对泄殖腔发育信号通路网络的影响。③进一步探讨孕早期使用HCG能否更有效的降低DBP的生殖发育毒性，并对其机制进行研究。本研究有助于我们加深对DBP毒性机制的理解，为寻找防治方法提供新的线索，同时对DBP与ARMs发生相关性提供了确实依据。

本研究通过检测肛门直肠畸形子鼠直肠末端组织中AR、AR相关及发育相关分子的基因和蛋白表达水平，进一步明确了DBP染毒致肛门直肠畸形的作用机制。同时，通过对全身多脏器大体、病理HE染色等形态学分析，并进行AR、Fgf10/ Fgfr2表达水平检测，提示在脏器的发育过程中，除了雄激素相关的信号通路外，还存在其他非雄激素依赖的信号通路，同样可能受到了DBP的干预，最终导致了多脏器发育不良。通过对正常对照、染毒未畸形和尿道下裂组子鼠的生殖结节进行检测分析，我们发现，AR和Srd5α2的相对升高可能是这些DBP染毒后未发生尿道下裂畸形鼠的重要保护因子。相对于畸形动物来说，染毒未畸形鼠中AR和Srd5α2相对高表达是维持其机体中睾酮相对正常浓度的保证，雄激素浓度在染毒未畸形鼠中相对的升高保证了尿道的正常分化和发育。Affymetrix 3’IVT表达谱芯片检测尿道下裂和正常对照雄性子鼠生殖结节中基因谱的表达差异，结果提示DBP还可能通过影响细胞紧密连接、物质代谢、细胞凋亡的多方面的因素引起畸形的发生。氧化应激和钙离子通道的改变可能DBP染毒致尿道下裂发生的相关机制密切相关。 进一步筛选出IP3R，研究结果提示妊娠期DBP可通过其氧化应激作用影响生殖结节的正常发育，使得尿道上皮细胞内钙离子浓度明显升高，导致细胞EMT被抑制，使得尿道板的发育及尿道沟的融合过程受到影响，引起了尿道下裂的发生。另外我们利用DBP成功诱导肛门直肠畸形合并尿道下裂复合畸形大鼠模型。发现在畸形鼠的末端直肠和生殖结节组织中，发育相关基因（Shh，Bmp4，wnt5a，Gli2，Gli3，Fgf10，Fgfr2，AR，Hoxa13，Hoxd13）均表达下调，畸形鼠的血清睾酮浓度和睾丸组织中睾酮合成相关基因的表达明显下降（Cyp11a1，Hsd3b，Scarb1，Star，AR，Srd5a2），提示肛门直肠畸形和尿道下裂的发生机制中存在共同相关的信号通路，由于肛门直肠以及尿道均来源于泄殖腔，因此上述两种畸形发生的关键时期就在胚胎的泄殖腔时期，并且可能受机体本身雄激素水平的调控。