载脂蛋白CⅢ直接或间接促进血管损伤再狭窄和动脉粥样硬化的机理研究

Clinical studies have indicated that hypertriglyceridemia（HTG） is an independent risk factor of atherosclerosis (As).The elevated plasma apolipoprotein CⅢ(apoCⅢ) is the characteristic manifestation and the major cause of HTG.Recently,Science and New England Journal of Medicine have reported that apoCⅢ gene polymorphism id related with the development of As. However, the mechanism of apoCⅢ promoting the As is still unclear.Our previous study showed first time that severe HTG lipoprotein lipase (LPL) deficient mice spontanousely developed atherosclerotic lesions via triglycerides-rich oxidative stress. Due to breeding difficulties of LPL deficient mice further research was limited. In recent years, we have generated HTG apoCⅢ transgenic mice and obtained an apoⅢ knockout mice.At the background of pro-atherogenic low density lipoprotein receptor deficient mice, we confirmed that high expression of apoCⅢ enhanced the atherosclerotic lesion.In this study, the mouse artery injury by guide wire model will be used to study the effect of apoCⅢ on the vascular injury restenosis and As based on the immunohistochemistry and other molecular biology techniques (RT PCR and Western blot).In vitro, the molecular mechanisms of apoCⅢ directly or via causing HTG promoting the development of As will be explored in macrophages and vascular smooth muscle cells using apoCⅢ rich- and absent-VLDL prepared from plasma of severe HTG mice. The excution of this project will make further understanding of the role of apoCⅢ in the pathological mechanisms of As and our finds will be of great theoretic significance and potential clinical value.

血浆载脂蛋白（apo）CⅢ升高是高甘油三酯血症（HTG）患者的特征性表现和主要诱因。《科学》和《新英格兰》等医学杂志相继报道apoCⅢ基因多态性与动脉粥样硬化（As）相关，然而apoCⅢ致As的机制目前尚不清楚。我们首次发现脂蛋白脂酶基因缺陷时可引起严重HTG并促进As发生，近期又成功制备和引进了apoCⅢ转基因和基因敲除小鼠模型，并与As易感的LDL受体缺陷小鼠杂交，初步发现apoCⅢ高表达可增加As病变。为明确apoCⅢ是直接或间接（通过HTG）促进As这个科学问题，本课题将应用上述小鼠模型以高脂饲料和导丝拉伤造成As和血管内膜损伤，采用免疫组化、RT-PCR和免疫印迹等技术研究apoCⅢ对血管病变的影响；同时从严重HTG背景的小鼠血浆中分离富含或无apoCⅢ的VLDL，观察apoCⅢ对泡沫细胞形成及平滑肌细胞增殖与迁移等的影响，并探讨其分子机制，为防治As提供新的干预策略和药物靶标。

高甘油三酯血症（HTG）与心血管疾病的关系一直存在争议。今年来，本项目组通过严重HTG的小鼠模型揭示了HTG与动脉粥样硬化之间的因果关系。大量的临床研究证实载脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）与HTG以及心血管疾病有紧密的联系，但是ApoCⅢ在体内如何影响血管再狭窄内膜增生以及动脉粥样硬化斑块仍然不甚清楚。另外，ApoCⅢ单独还是与HTG共同发挥作用也需要进一步的实验证据。.本实验从整体角度研究了ApoCⅢ在血管再狭窄和动脉粥样硬化中的作用，并通过细胞实验阐明了富含以及不含ApoCⅢ 的甘油三酯脂蛋白（TRLs+/-ApoCⅢ）对平滑肌细胞增殖的影响。.体内实验中，我们对以下三组小鼠进行了颈总动脉内膜剥脱术：低拷贝ApoCⅢ转基因(ApoCⅢtg)/Ldlr-/-与Ldlr-/-；高拷贝ApoCⅢtg/Ldlr-/-与Ldlr-/-；高拷贝ApoCⅢtg、ApoCⅢ-/-/Ldlr-/-和WT小鼠。分析了高脂喂饲后低拷贝ApoCⅢtg/Ldlr-/-与/Ldlr-/-的动脉粥样硬化情况。将ApoCⅢ转基因（ApoCⅢtg）和ApoCⅢ敲除（ApoCⅢ-/-）与严重高甘油三酯血症GPIHBP1-/-小鼠杂交构建了双基因修饰的ApoCⅢtg/GPIHBP1-/-以及ApoCⅢ/GPIHBP1 DKO小鼠。通过超速离心，从其血浆中分离出具有天然生物活性的TRLs+/-ApoCⅢ用于体外实验。.与对照组小鼠相比，ApoCⅢtg小鼠表现出严重的高甘油三酯血症，颈总动脉内膜剥脱术后14天新生内膜增生明显。增殖标记物PCNA、巨噬细胞标记物Mac-3以及粘附分子VCAM-1的表达均明显增加。但ApoCⅢ-/-和野生型小鼠之间无明显差异。体外实验中，富含ApoCⅢ的TRLs能显著促进平滑肌细胞增殖以及VCAM-1的表达，并且激活Erk,p38和Akt信号通路，提高细胞内氧化水平。而不含ApoCⅢ的TRLs的作用不明显。体外给以活性氧清除剂MPG后，TRLs+ApoCⅢ促进平滑肌细胞增殖活化的作用被抵消。.我们的研究结果证实ApoCⅢ转基因所致HTG能明显促进内膜剥脱术后血管再狭窄以及动脉粥样硬化的发生，并且首次发现ApoCⅢ本身对平滑肌细胞的促增殖作用。