微藻生物合成虾青素的调控机制

Astaxanthin is a secondary carotenoid with crucial protective roles in photosynthetic organisms subjected to adverse environment. As a superior antioxidant and coloring agent, astaxanthin possesses great potential in pharmaceutical and cosmetic industries, as well as aquaculture. The unicellular green alga Haematococcus pluvialis is the major commercialized source of natural astaxanthin. This project aims to unravel the regulatory mechanisms underlying astaxanthin biosynthesis in H. pluvialis at systems level. Two hypotheses are proposed in this proposal: 1) at the metabolic level, free astaxanthin synthesized at the endoplasmic reticulum can be esterified with fatty acids, which in turn relived the feedback inhibition of astaxanthin biosynthesis by the end product (free astaxatnhin) and stimulated the enzymatic reaction; 2) at the subcellular level, the newly synthesized astaxanthin esters are sequestered into the lipid bodies, and are therefore separated from the site where the enzymatic reactions occurred, which enhanced the accumulation of astaxanthin. Based on these two hypotheses, tools of molecular and cellular biology, biochemistry, genetics, and multi-omics will be employed to identify the genes involved in astaxanthin esterification and lipid biogenesis, and to understand their roles in regulating astaxanthin accumulation in this organism. This project will not only advance our understanding on biosynthesis of secondary carotenoids in unicelluar photosynthetic organisms, but also will impel the biotechnical industry of astaxanthin and Haematococcus.

虾青素是一种次生类胡萝卜素，对逆境条件下生长的光合生物具有重要的保护作用；同时作为一种高效抗氧化剂和着色剂，在医药、化工及水产养殖等行业有巨大的应用前景。雨生血球藻是目前天然虾青素的最主要的来源。本项目将以血球藻为模式生物，在系统水平上研究血球藻中虾青素生物合成的调控机制。本项目提出了两个假设：首先，在代谢层面，虾青素单体在内质网的酯化能够有效解除产物反馈抑制效应，促进反应向正向进行；在细胞层面，新合成的虾青素酯能被储存于脂肪体中，在空间上与酶学反应发生的位置（内质网）隔离，该过程进一步促进虾青素生物合成及积累。围绕上述假设，将运用分子细胞生物学、生物化学、遗传学及多组学的方法，通过鉴定与酯化及脂肪体形成相关的基因、解析基因与虾青素积累的关系，揭示血球藻过量积累虾青素的机理。本项目的实施不仅有助于深化对单细胞光合生物积累次生类胡萝卜素的理解，还将促进血球藻/虾青素相关生物技术的发展。

雨生血球藻（简称红球藻）是一种普遍存在的绿藻，在培养过程中，其细胞在高光强或缺氮胁迫下可大量产生虾青素，最高可达干重4%。虾青素是最强的天然抗氧化剂之一，应用广泛，目前获取虾青素的途径主要通过藻类培养获取。关于虾青素在血球藻中的合成途径研究表明，虾青素是在内质网合成，并通过一种未知酶将其酯化成虾青素酯，并转移到脂肪体中，从而解除虾青素的底物抑制作用，使得虾青素可以不断产生和积累。通过引入酯酰辅酶A：二酯酰甘油酰基转移酶Diacylglycerol Acyltransferase, （DGAT1 和DGAT2）抑制剂的研究表明，这种虾青素酯化酶很可能是DGAT。本项目利用分子生物学方法获得了血球藻中5个DGAT的编码基因，在甘油三酯（TAG）合成缺陷型酵母Saccharomyces cerevisiae H1246中过表达HpDGAT基因发现除了HpDGTT2，其他4个拷贝的DGAT可回补H1246的表型，合成TAG。利用分离得到的雨生红球藻的内质网成功地建立了一个体外的虾青素酰基转移酶酶活测定体系，经验证HpDGAT1和HpDGTT2可以使某些虾青素酯峰产生净增。但进一步经利用E.coli BW-ASTA系统建立的体内实验结果表明，仅有HpDGAT1过表达的转化子可以相对于对照组产生特异酯峰。然而该酯峰经LC-MS检测发现是非虾青素的色素酯峰。我们根据高光胁迫下雨生红球藻RNA-seq数据，另外鉴定克隆了两个高表达的酰基转移酶，蜡酯合成酶（WaxS）和磷脂酰胆碱：固醇酰基转移酶（LCAT）。但经过体内和体外实验证明这两个酶也不具有合成虾青素酯化酶活性。我们对HpDGTT2进行可溶性表达，通过筛选不同酰基受体发现该重组蛋白可在体外具有溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）活性，且在衣藻中过表达HpDGTT2的转化株具有与过表达衣藻质体CrLPAAT1相似表型，从而佐证HpDGTT2的LPAAT体内活性。该发现在微藻界尚属首例，对理解微藻多拷贝DGAT2家族基因现象，以及蛋白结构与功能的关系等领域具有重要的指导意义。对红球藻高光胁迫下的脂肪体进行蛋白质组学分析，鉴定到两个可能与虾青素存储相关的蛋白。我们也建立了红球藻的EMS突变体库和突变体高通量筛选方法。本项目的研究成果为以红球藻为细胞工厂生产虾青素提供了技术支持和研究基础。