抗牙龈卟啉单胞菌HagA、FimA蛋白DNA疫苗的研制及其作用机制研究

Porphyromonas gingivalis is closely related with peridontitis and its important cell surface virulence factors include gingipains and pilus.The adhesion domain of gingipains is likely to be adhesion ligands which offer Pg to intrude into the first natural barrier of the gingival epithelial cells. Fimhrillin can mediate the adherence of Pg , host cells and other bacteria in oral cavity. IL-15,an adjuvant cytokine, can enhance IgA response in vivo .In this experiment,we built periodontal gene vaccines to prevent peridontitis which include gene hagA which from the adhesion domain of gingipains,gene fimA from Pilus and IL-15. Through detect the expression of vaccines in eukaryotic cells,role of the cell proliferation active and cytotoxic activity of CD8+ T lymphocytes and NK cell produced by IL-15,compare the levels of specific antibodies after immune the rat and the protective effect of periodontal tissues after immune periodontal animal model,observe whether Tfh cells promote by its relative factors that gene vaccine could induce the production of sIgA and participate in the conversion of the types of immune globulin in mucosal immunity,to investigate the mechanism and feasibility of prevention periodontitis by gene vaccine.

牙龈卟啉单胞菌（Pg）与牙周炎密切相关，其重要的毒力因子包括牙龈素和菌毛。牙龈素的血凝集素/黏附结构域是Pg侵入牙周第一道天然屏障牙龈上皮细胞的粘附配体，菌毛蛋白能够介导Pg与宿主细胞和口腔内其他细菌的粘附，IL-15作为一种辅助性的细胞因子可以增强体内IgA的反应。本实验拟通过构建包括血凝集素基因hagA、菌毛蛋白基因fimA和IL-15基因的真核表达质粒作为牙周病基因疫苗来防治牙周炎。通过检测其在真核细胞中的表达， IL-15对CD8+T淋巴细胞和NK细胞增殖活性和细胞毒活性的作用，比较疫苗免疫大鼠后的特异性抗体水平和免疫牙周病模型动物后对牙周组织的保护作用，观察Tfh细胞是否通过其相关因子促进了基因疫苗在免疫过程中产生sIgA抗体以及参与免疫球蛋白类型的转换，探讨牙周炎基因疫苗免疫防治牙周炎的机制及可行性。

牙周炎是一种口腔常见疾病，牙龈卟啉单胞菌是公认的主要致病菌之一，目前临床对于牙周炎的治疗方法不能取理想的效果。因此，寻找一种新的防治牙周炎的方法显得尤为重要。本研究应用牙龈卟啉单胞菌的两个重要独立因子的编码基因HA2、fimA，细胞因子佐剂IL-15构建了抗牙龈卟啉单胞菌的牙周炎基因疫苗 pVAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15 pVAX1-HA2-fimA、pVAX1-HA2-fimA/IL-15。检测了其在真核细胞的表达，经鼻黏膜免疫后对SD大鼠的免疫原性及对实验性牙周炎的保护作用。以及经鼻黏膜免疫牙周炎基因疫苗后Tfh细胞的变化，IL-15对SD大鼠肠系膜淋巴结B淋巴细胞增殖的影响，初步探讨牙周炎基因疫苗的免疫机制及用IL-15提高基因疫苗免疫效应的可能性。重要结果：1.质粒构建结果：目的基因经PCR扩增，经限制酶NheI及XhoI酶切后电泳及测序后，成功扩增出了目的基因条带，酶切后得到了预期大小的片段，经比对，筛选插入位置、方向与预期相同，且无基因突变；重组质粒在体外成功转染真核细胞293T，经Western Blot检测细胞中分别正确表达出15 KD的HA2蛋白和42 KD的FimA蛋白。2.免疫原性实验结果：A、B组免疫的大鼠唾液标本抗HA2和FimA的sIgA型抗体。免疫组织化学观察结果为HA2蛋白主要表达于细胞质，FimA蛋白主要表达于细胞质及细胞间质。实验性牙周炎保护作用结果：实验组TNF-α、MMP-8 mRNA低于牙周病组，且差异有统计学意义（P＜0.05）；相同剂量的疫苗含佐剂IL-15组大鼠牙槽骨吸收量少且差异有统计学意义（P＜0.05）。3. C组FITC(CD4)和Aleax flour 594(CXCR5)融合后显黄色荧光，A组和B组的免疫荧光双染结果中未见双阳性荧光信号；C组大鼠鼻黏膜细胞中CD4+CXCR5+Tfh及CD4+CXCR5+ICOS+Tfh细胞的表达均高于A组和B组(p＜0.05)；且发现大鼠唾液中特异性SIgA抗体水平与大鼠鼻黏膜CD4+CXCR5+Tfh及CD4+CXCR5+ICOS+Tfh细胞表达均呈正相关关系；A组B细胞增殖水平高于B组和C组（p<0.05）；A组B淋巴细胞CKs2 mRNA相对表达量高于B组（p＞0.05）。A组B淋巴细胞分泌的特异性IgA水平均高于B、C组（p＜0.05）。