柑桔木虱外周嗅觉编码的分子机制

Diaphorina citri originated on the Indian Subcontinent, and introduced to China in the early 1930s. Diaphorina citri are known to have co-evolutionary relationships with the host plant. In addition to that a relatively simple olfactory system adapted to the host plant, Diaphorina citri odorant receptor (OR) repertoire are minor. But Diaphorina citri odorant receptor coding for recognition of host characteristic compound was unknown. In this study, we will combine multiple techniques including bioinformatics method, full-length transcript sequencing, real-time fluorescent quantitative PCR, immunocytochemical localization, CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling, heterologous expression systems, Drosophila “empty neuron” system, electrophysiological study, behavioral study and RNA interference (RNAi) to achieve the following four objectives. 1) Identification of OR. 2) OR location in the olfactory sensilla and olfactory receptor neuron. 3) Investigating of OR reception in host characteristic compound. 4) Testing the impacts of RNAi knockdown of the candidate OR on the electrophysiology and behavior. Accomplish of this project will enhance our knowledge of molecular mechanisms for odor coding in the peripheral olfactory system of Diaphorina citri, and be available to us to help utilize the target molecule and computer algorithm to design and synthesize the novel attractants.

柑桔木虱起源于印度大陆，于1930年传入我国。柑桔木虱与寄主植物协同进化，除了以简单的嗅觉系统适应寄主植物外，还发现柑桔木虱（odorant receptor，OR）基因数目相对有限。然而，柑桔木虱OR识别寄主植物特征化合物编码机制还不清楚。本项目将综合运用生物信息学、全长转录测序、荧光定量PCR、免疫组化、CRISPR/Cas9介导的荧光原位杂交、异源表达、果蝇活体表达、电生理和行为学研究技术完成以下4项研究：（1）柑桔木虱OR的鉴定；（2）该虫OR在触角感器和嗅觉神经元的定位；（3）该虫OR对寄主植物特征化合物的识别反应，（4）通过RNAi技术研究柑桔木虱缺失特定OR后的电生理和行为反应。本项目完成将有利于阐明柑桔木虱OR对寄主植物特征化合物的外周嗅觉编码机制，且有利于我们更好利用靶分子和计算机学习算法进行新型引诱化合物的设计和合成。

柑桔木虱是柑桔黄龙病的重要传播媒介，“防虫治病”是对柑桔黄龙病的重要管理措施。目前的生物防治或者化学防治对柑桔木虱防治难以奏效，需要发展“推-拉”防治策略。植食性昆虫对寄主植物的嗅觉识别机制是“推-拉”防治重点研究方向，通过对柑桔木虱对特定气味化合物识别机制研究将开启新型“推-拉”防控重要步骤。本项目系统地鉴定了柑桔木虱化学感受基因，其中包括13个气味受体OR，15个离子型受体IR，9个气味结合蛋白OBP，12个化学感受蛋白CSP。综合转录测序和荧光定量PCR方法发现3个气味受体OR；2个离子型受体IR；8个气味结合蛋白OBP；4个化学感受蛋白CSP特异或高表达于触角的化学感受基因，继而分析了在木虱不同发育时期的表达水平，最终推导柑橘木虱参与嗅觉识别的化学感受基因。利用荧光竞争结合测试、分子对接技术和RNAi技术证实了参与感知植物源化合物的气味结合蛋白OBP、化学感受蛋白CSPs和气味受体ORs，并利用分子对接分析了特定OBP和CSP与植物源化合物的结合中的关键结合位点。本项目成果将对柑桔木虱新型行为干扰剂的开发具有重要参考价值。