镉毒作用过程中特异基因甲基化改变的体内外动态分析与人群调查

申请者前期已发现2个新的鼠属镉应答原癌基因(TIF3、TEF-1δ)，前2个国家基金研究又发现镉恶性转化人细胞和镉慢性中毒动物中这2个应答基因表达异常升高和多个DNA修复基因表达下调而未涉及其序列改变，提示镉毒作用中表遗传可能起重要作用。本项目以此为基础，用MSP法和甲基化CpG岛在线软件有针对性动态探讨和确认镉恶性转化人细胞不同阶段应答基因及DNA修复基因的甲基化状态，论证慢性镉中毒大鼠血及肝、肾、肺、心等靶器官镉浓度和特异损害与相关基因甲基化及表达情况之间的关系，揭示镉相关基因甲基化模式与规律，发现镉特异甲基化生物标记和靶标信息。同时对镉暴露人群进行采样和健康调查，以MSP法和Real-Time PCR检测血白细胞上述基因甲基化状态和表达水平，进一步验证他们之间的相关性及其与镉暴露和毒效应的关系。这将有力阐明镉毒作用的表遗传机制，对职业人群生物监测和高危人群筛选均有重要意义和应用前景。

本项目运用高压液相色谱、荧光定量PCR、Western Blot和甲基化特异性PCR等方法，在分子、细胞、动物和人群水平上对镉毒作用过程中特异基因甲基化改变进行体内外动态分析与人群调查。研究发现，镉恶性转化人支气管上皮细胞(16HBE)中有多个DNA修复基因(hMSH2, ERCC1, XRCC1, hOGG1)表达下调并出现明显的高甲基化现象，其表观遗传机制主要涉及DNA 总体甲基化水平上调，并与DNA 甲基转移酶DNMT1和DNMT3a的过量表达相关。在镉毒作用大鼠靶器官(肝、肾、肺、心等)相关基因翻译区突变及DNA甲基化的研究中，未见异常表达的应答基因(eIF3 p36和EF-1δp31)翻译区有突变情况，也没有看到这些基因启动子的CpG岛异常甲基化现象；同时，在镉毒作用靶器官中发现3个常见的DNA修复基因(ERCC1、XRCC1、hOGG1)表达明显下调，而其基因组无甲基化变化，提示这些镉毒作用相关基因差异表达可能不是甲基化导致，可能受到非编码RNA或其他因素调控。我们进一步探讨了镉暴露和对照人群白细胞eIF3 p36和EF-1δp31等基因的表达情况、作用功能和甲基化状态，发现镉暴露人群的eIF3 p36和EF-1δp31基因表达异常升高，有明显的剂量-反应关系，但尚未观察到这些基因甲基化状态的明显变化。结合细胞、动物、人群资料，我们初步揭示和论证了镉毒作用过程中特异基因甲基化改变的体内外动态和相关机制。此外，我们还应用抑制消减杂交方法,构建了镉诱导转化16HBE细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步大量筛选和克隆镉相关特异性表达的新基因奠定基础。我们的研究取得了多项成果，达到了国际先进水平，对职业人群生物监测和高危人群筛选均有重要意义和应用前景。本项目在国内外专业杂志和国际学术会议上发表论文共10篇，其中1篇高水平学术论文在国际毒理学最高杂志Toxicol Sci (IF=5.093)上发表，有2篇动物和人群研究论文分别在Int J Mol Sci (IF=2.598)、Biomarkers (IF=2.215)上发表，还有1篇优秀论文参加了2013年在韩国举办的第八届国际毒理学大会并在专题会议上报告。目前培养毕业和在读的博士和硕士研究生5名，同时培养青年教师及研究人员等4名。