谷氨酰胺酶抑制剂联合顺铂抗神经母细胞瘤的作用及其机制研究

Effective treatment and early response assessment of high-risk neuroblastoma (NB) are clinical challenges for breakthrough. It has been confirmed that the survival and proliferation of MYCN-amplified NB cells are highly dependent on glutamine (Gln) metabolism and glycolysis. Our preliminary study has demonstrated that NB tumor xenografts exhibited increased uptake of 18F-FGln, which was more significant in MYCN-amplified tumors. Thus, we hypothesize that combination of glutaminase inhibitor with cisplatin will induce metabolic crisis and lead to autophagy or apoptosis in tumor cells. This proposed research project aims to verify the treatment efficacy by simultaneous inhibition of Gln metabolism and glycolysis and to calculate the combination index; to determine its impact on AMPK signaling pathway, apoptosis and autophagy-related protein, on expression of oncogenes including MYC and HIF1α and their downstream targets both in vitro and in vivo by Western blotting and immunohistochemistry; to study glycolysis and Gln metabolism changes in vivo under this treatment strategy and to explore the feasibility of using 18F-FGln for early treatment response assessment. This project is to offer theoretical evidence and new strategy from the perspective of energy metabolism for treatment of patients with NB.

高危神经母细胞瘤（NB）的治疗及早期疗效评价是临床亟待突破的难题。已有研究证明MYCN扩增的NB高度依赖谷氨酰胺（Gln）代谢与糖酵解以维持细胞生长及满足大分子合成需要。由此本项目提出基于联合用药抑制肿瘤能量代谢对NB进行干预的新策略。我们前期研究证实荷瘤鼠NB瘤灶18F-FGln摄取增高、MYCN扩增者尤著。本项目拟从细胞、动物模型水平验证通过谷氨酰胺酶抑制剂降低Gln代谢，联合顺铂抑制糖酵解的特性，使NB细胞产生能量代谢危机并凋亡，计算药物联合指数。采用免疫印迹、免疫组化等方法检测其对MYCN不同扩增状态的NB代谢相关蛋白、凋亡及自噬相关蛋白、AMPK信号通路的影响，并深入探讨其内在机制。通过microPET/CT显像观察并验证此治疗策略下肿瘤葡萄糖及Gln代谢的改变，探索18F-FGln作为早期疗效评价示踪剂的可行性。本项目的实施从能量代谢角度为NB治疗探索新思路并提供重要理论依据。

近几十年来，通过对高危神经母细胞瘤患儿采取积极的多学科治疗，其生存结局已得到显著改善，然而长期生存率仍不足50%。并且由于多重治疗所致各种并发症的出现给幼儿及青少年的健康成长带来了极大的阻碍，甚至产生第二肿瘤。目前高危神经母细胞瘤，尤其是复发性神经母细胞瘤的治疗尚无重大突破，是临床面临的主要困境。相关研究已表明MYCN扩增型神经母细胞瘤需要大量的外源性谷氨酰胺维持其不断增殖。我们前期研究证明MYCN扩增型神经母细胞瘤主要通过谷氨酰胺转运体2摄取谷氨酰胺，并可采用18F-FGLN micro-PET/CT早期评估肿瘤的恶性程度及治疗效果。本项目在前期研究的基础上针对谷氨酰胺代谢通路关键酶GLS进行干预，并联合传统化疗药物顺铂，希望为临床高危型患者提供一种新的治疗思路。本研究以MYCN扩增型和非MYCN扩增型神经母细胞瘤细胞系为研究对象，采用不同的谷氨酰胺代谢干预手段（谷氨酰胺酶抑制剂CB839、谷氨酰胺拮抗剂DON/JHU083、顺铂DDP及其联合用药），在细胞及动物水平观察研究其抗肿瘤效果。结果显示MYCN扩增型神经母细胞瘤（SK-N-BE(2)）增殖抑制对CB839最为敏感，非MYCN扩增型神经母细胞瘤对DON敏感；CB839联合顺铂对神经母细胞瘤增殖显示出显著的抑制作用，并优于单独用药。通过细胞代谢组学分析，我们发现谷氨酰胺代谢受抑或拮抗后，肿瘤细胞通过增加内源性谷氨酰胺来维持氧化磷酸化水平，因此单纯谷氨酰胺酶抑制治疗可能对神经母细胞瘤抗肿瘤效果有限。我们进一步通过构建GLS敲减神经母细胞瘤株发现GLS敲减后神经母细胞瘤细胞表现出增殖抑制及迁移侵袭能力减弱，说明GLS在神经母细胞瘤增殖及转移方面扮演着重要角色，为肿瘤治疗提供潜在靶点。我们发现当谷氨酰胺代谢阻断后，神经母细胞瘤 PI3K-AKT-mTOR/GSK-3beta通路相关蛋白发生改变，提示该通路可能是其调控生长的重要信号通路，值得我们今后进一步研究。综上，我们通过联合谷氨酰胺代谢干预联合抗肿瘤药物后从体内、外实验证明联合用药抗神经母细胞瘤效果较单一用药更显著，为临床治疗神经母细胞瘤，尤其高危组患儿提供了新的治疗思路。