茄子候选抗病基因的特性与功能鉴定

茄子是我国的一种重要蔬菜，其生产上经常会受到病害的危害，由于茄子栽培品种抗病资源的缺乏，难以培育出抗病品种。通过基因工程的方法，把野生资源中的抗病基因导入到栽培品种以提高其抗性，为茄子的抗病育种找到一条新的途径，而要开展抗病基因工程研究，必须尽可能分离较多抗病基因才有突破。本项目是在从抗病半野生茄子材料中分离得到一个候选抗病基因（RE-bw）基础（对其表达特性和结构进行初步分析，与已克隆的抗病基因具有较高的同源性）上，进一步深入研究该基因的功能与分子生物学特性。首先把该基因在酵母中进行表达，分析表达蛋白对茄子一些病害的病菌生长是否有抑制作用；同时把该基因正义表达载体导入到感病番茄或茄子中，把该基因RNAi载体转到供体材料中，对获得的转基因植株进行抗病性鉴定，比较抗病性是否增强；同时继续研究该基因的一些表达特性，以探明该基因的功能，为开展茄科蔬菜作物抗病基因工程研究打下基础。

本研究利用cDNA-AFLP技术从抗青枯病茄子中获得抗青枯病的EST片段，结合RACE技术，获得该基因的全长序列,命名为RE-bw，该基因长1210bp， 包含了一个1116bp的完整ORF和Poly(A)尾巴，对其结构分析表明，该基因片段含有一个NBS-LRR结构域，同时含有一个转录因子保守区域（WRKY）。 同源性分析，与已经克隆的抗病基因具有不同程度的同源性。对该基因的分子特性研究表明，该基因可能以2个拷贝的形式存在基因组中；表达特性分析表明该基因只在抗性材料（E-31）的根、茎部表达，在叶片中不表达，表达具有组织特异性，而在感病材料中的根、茎、叶器官均不表达。接种青枯病菌能够诱导该基因的表达，而接种黄萎病菌不能诱导该基因表达；外施水杨酸能够诱导该基因的表达，茉莉酸不能诱导该基因的表达。该基因在E-31和E-32的F2代分离群体中，与抗病植株密切连锁，而在感病植株中没有该基因的存在。同时对该基因进行了酵母表达的研究，获得表达产物，表达产物对青枯病菌生长具有抑制作用。对该基因进行转基因功能验证，结果表明，把该基因导入到感病番茄中，能够提高番茄抗青枯病能力；利用RNAi和VIGS把该抗病基因在抗性材料E-31中沉默，E-31抗青枯病能力下降，因此从正反两方面验证，RE-bw基因是一个具有抗青枯病功能的关键基因。利用抗病材料E-31 和感病材料E-32 为试材，分别选择SA,JA和ET调控抗病途径的一些信号基因进行进行表达特性分析。选择了EDS1、PAD4、NPR1、SGT1、WRYK70，JAR1，NDR1，EIN2，RAR1等9个信号基因，结果表明EDS1、PAD4、NPR1、SGT1、WRYK70等基因可能与调节茄子抗青枯病抗性反应有关，而JAR1、NDR1、EIN2、RAR1等基因可能与茄子调控青枯病反应不太相关，推测，调控茄子抗青枯病的信号途径可能一水杨酸为主。