基于不同种慢生根瘤菌的多位点基因序列的芯片分析

慢生根瘤菌具有广泛的自然地理分布和宿主共生特性，并能与多种重要经济豆科植物建立共生固氮体系，在农业的可持续发展中占有重要地位。与其它的根瘤菌相比，慢生根瘤菌分类鉴定相对滞后，目前仅有8个种被命名，许多研究表明慢生根瘤菌中蕴藏着丰富的未知种质资源有待进一步发掘。由于慢生根瘤菌生长速度慢，16SrRNA基因序列同源性高，使得利用传统的和近现代的分类方法很难将其很好的区分。目前多位点基因序列分析技术已被国际学者广泛用于慢生根瘤菌的分类鉴定中，它被认为是很有潜力的、有可能取代DNA同源性杂交分析的新技术。本研究拟率先将多位点基因序列分析技术与基因芯片技术有机结合，通过设计和筛选不同检测水平的特异性探针，杂交条件优化，与DNA-DNA同源性测定比较分析等研究，建立起慢生根瘤菌准确、快速分类鉴定的新技术平台，为进一步高效的发掘慢生根瘤菌新种质资源和开展慢生根瘤菌的生态学研究提供强有力的技术支持。

慢生根瘤菌具有广泛的自然地理分布和良好的宿主共生特性，且能与多种重要经济豆科植物（大豆、花生、菜豆等）建立共生固氮体系，在现代生态农业系统中发挥着重要作用。在多位点基因序列分析和比较基因组学应用于慢生根瘤菌分类及生物多样性研究之前，慢生根瘤菌的分类进展十分迟缓。随着这两项技术的成熟应用，慢生根瘤菌属的新种已从原来的8个种迅速发展至18个种，并且在未来的几年里还有新种数量倍增的趋势。本项目的研究工作是伴随着更多慢生根瘤菌的新种质资源被发掘的同时展开的，在充分利用和挖掘GenBank中已有的不同种慢生根瘤菌多位点基因序列资源基础上，寻找和设计大量寡核苷酸探针（约336个，主要分布在recA、atpD、nifH和nodC基因），制备了可以检测不同种慢生根瘤菌的基因芯片，并通过杂交试验优化杂交条件，确定了杂交温度55℃，杂交盐离子缓冲液为0.5×SSC，作为杂交的最佳条件。在此基础上，对各种探针进行筛选并与DNA-DNA杂交结果比较分析，获得了能够在种水平上特异的探针86个。将这些探针用于检测分离和采集自不同地区和宿主的慢生根瘤菌菌株、根瘤和豆科植物根面及根际土壤，都获得了理想的杂交结果。与相应的植物根际及土壤根瘤菌克隆文库比较分析，结果存在明显差异，造成这种差异的原因有待进一步深入探究。通过本项目的研究，发现了慢生根瘤菌的新种群2个，并建立了深入研究慢生根瘤菌生态适应性的基因芯片快速检测平台，为进一步更好地挖掘和利用慢生菌资源奠定良好基础。与此同时，应用本研究建立起的慢生根瘤菌基于recA基因的芯片和克隆文库比较分析发现，与广金钱草共生的慢生根瘤菌有埃氏慢生根瘤菌、豆薯慢生根瘤菌、大豆慢生根瘤菌，以埃氏慢生根瘤菌为主。