ENO2调控HMGB1亚细胞定位和分泌影响肝癌恶性潜能及其在索拉非尼耐药中的作用和机制的实验研究

Enolase 2 (ENO2) is an important molecular associated with the invasion and metastasis potential of hepatocellular carcinoma (HCC), but its mechanism is not clear. Our previous study of co-immunoprecipitation and high-throughput proteomic mass spectrometry analysis confirmed ENO2 binding and interaction to an important intracellular non-histone chromosomal binding protein：high mobility group box-1 (HMGB1). The subcellular HMGB1 localization and secretion regulated by ENO2 and its downstream signaling pathway that affect invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells. In addition, previous studies showed that the expression level of modified ENO2 protein increased significantly in sorafenib resistant cell line, and the serum HMGB1 concentration in HCC patients is reported as an independent predictor of poor therapeutic effect of sorafenib. To further clarify the ENO2 mechanism in HCC metastasis, we want to: (1) clarify the molecular mechanisms of ENO2 regulation subcellular HMGB1 localization and secret; (2) reveal the effects of subcellular HMGB1 localization regulated by ENO2 on HCC malignant potential; (3) analysis the correlation of ENO2-HMGB1 protein complex and HCC clinicopathological features and prognosis, to find its effect and mechanism in resistance of sorafenib. We hope to find new target for the treatment of HCC，for screening and identification of sensitive population of sorafenib treatment and new target for treatment in resistance patients.

烯醇化酶2（ENO2）是肝癌恶性潜能相关重要分子，但其具体机制目前并不清楚。我们前期研究通过免疫共沉淀和高通量比较蛋白质组学-质谱分析，证实ENO2与细胞内一个重要的非组蛋白染色体结合蛋白HMGB1相互作用，影响HMGB1在细胞中的定位与分泌，调控其下游信号传导通路影响肝癌细胞侵袭和转移。我们发现在索拉非尼耐药细胞株中ENO2修饰蛋白表达水平显著升高，且文献报道肝癌患者血清HMGB1浓度是索拉非尼治疗效果差的独立预测因素。为了进一步明确其作用机制，拟开展以下研究：（1）阐明ENO2调控HMGB1蛋白细胞定位和分泌的分子机制；（2）揭示ENO2调控HMGB1亚细胞定位对肝癌恶性潜能的影响；(3)分析ENO2-HMGB1蛋白功能复合体与肝癌临床病理特征及预后的相关性，并对其在索拉非尼耐药中的作用和机制进行研究。为寻找肝癌诊治新靶点，筛选鉴别靶向治疗敏感人群和寻找耐药干预新靶点提供新的依据。

按照课题的研究计划开展了研究工作。用不同颜色荧光标记ENO2和HMGB1，在全内反射荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察ENO2表达高低对HMGB1亚细胞分布的影响。虽经长时间多次反复重复试验，未能得出明确的结果，有时候有截然相反的结果。考虑到两者是否存在相互调控和亚细胞分布改变是后续工作的关键基础，随后经过课题组讨论决定寻找二者之间可能的其他调控方式，后续工作完成后会对其结果和成果进行补充。.课题组对ENO2在胰腺癌（PDAC）中的作用及其机制进行了研究，发现ENO2在PDAC组织中显著过表达并与患者的转移和预后不良相关。ENO2基因敲除可抑制PDAC肿瘤生长和肝转移。ENO2 K394位点的脱乙酰基促进PDAC的转移。IGF-1/PI3K/Akt/mTOR通路可诱导K394去乙酰化刺激ENO2活性，促进PDAC肝转移。IGF-1R抑制剂如linsitinib可阻断IGF-1诱导的ENO2脱乙酰化，是一种有潜在临床应用价值的干预策略。.我们发现CHRNA5在人肝癌（HCC）组织中的表达增加，并与患者临床分期及不良预后相关。CHRNA5通过调节YAP活性来调节HCC的增殖能力。通过调控干性相关基因促进干性维持和表达，通过调控EMT相关基因促进HCC转移，还可以影响索拉非尼治疗的敏感性。CHRNA5在HCC的进展和耐药中起着关键作用，靶向CHRNA5是治疗HCC策略之一。.我们对KLF4在HCC预后及HCC进展中的作用进行了研究。我们发现与癌旁组织相比，KLF4在HCC中的表达显著下调，KLF4低表达HCC总生存率(OS)和无复发生存率(RFS)均显著低于KLF4高表达的患者。KLF4可以抑制HCC细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化。KLF4不仅是肝癌中的一种肿瘤抑制因子，而且可以作为一种有价值的预后因子和潜在的干预靶点。.我们对肝癌耐药相关的分子机制进行了研究。约75%的肝癌标本显示hedgehog GLI1转录因子的表达较癌旁升高。低分化HCC细胞中GLI1/2和TAP1蛋白水平均显著升高。通过RNAi方法或特异性GLI1/2抑制剂GANT61抑制GLI1或TAP1基因后，对索拉非尼、阿霉素和顺铂的敏感性均显著提高。发现TAP1受hedgehog信号的直接转录控制，靶向hedgehog信号可为缓解难治性肝癌的耐药性提供了新的思路和潜在的靶点。.