家蚕丝素蛋白凝聚态结构调控及细胞功能相关性基序研究

家蚕丝素是一种天然动物蛋白，近年来在生物医用材料领域越来越受到关注。作为组织修复用材料应具备与之匹配的生物力学性能和生物相容性，因而凝聚态结构调控及与细胞相互作用机制，是丝素蛋白用作生物材料前需研究的重要基础问题。为系统地阐明丝素蛋白结构控制、细胞功能的序列结构因素，本课题提出了采用基因重组技术，根据丝素肽链规整、重复、嵌段交替的组成特征，设计编码丝素蛋白的典型结构单元基因，通过基序组合、嵌段重组，采用原核或酵母系统表达重组蛋白（肽），系统分析研究各基序或基序组合对丝素蛋白分子构象形成的作用，与结晶结构形成的内在关系。选择皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞作为典型细胞，研究基序或基序组合对细胞的黏附、增殖或分化作用，及对细胞因子分泌的影响，探索细胞作用的特异性位点及其机理。为丝素蛋白生物医用新材料的研制、拓展应用领域提供理论指导。

蚕丝引起了国内外生物材料研究者的极大关注，但作为缺损组织修复材料使用还不够十分理想，不明白丝素是否有利于细胞相互作用的理论依据。为此，本项目采用基因工程技术研究了其主要序列的结构和生物学（与细胞作用）功能。具体工作如下：.1、家蚕丝素蛋白重链非重复区肽段的制备与表征.根据非重复区序列特征，设计并分段合成了非重复区基因序列f（1），编码非重复区类似物GAFDSESSAEGSSANAVPGFGSSGFDSESSAEGSGGNAVPGFGSGT，通过首尾连接加倍获得了2~12倍的延续片段f（2）~f（12），构建并筛选了pGEX系列的表达载体，获得了各种肽段GST-F（n）的稳定表达，重点探索了三种融合蛋白GST-F1、GST-F4和GST-F8的高效表达。.质谱鉴定纯化后GST-F1、GST-F4和GST-F8以及释放的目的多肽F1、F4和F8的分子量与设计肽段的理论分子量一致，它们的等电点和氨基酸组成测定结果也与理论值相符合。结果说明了表达产物符合预期设计的目的序列。.2、家蚕丝素蛋白重链重复区与非重复区肽段的重组制备与表征.完成了四种重复区典型肽段GA16、GS16、GY16和GV16与非重复区编码基因的重组克隆ga16f1、gs16f1、gv16f1、gy16f1、gs16f2、gs16f3、gs16f4、gs16f8和gs16f12，构建了各重组蛋白pGEX系列的表达载体，表达产物GA16F1、GS16F1、GV16F1、GY16F1及GS16F2、GS16F3、GS16F4、GS16F8、GS16F12获得了有效表达。重点探索了GST-GS16F1，GST-GS16F4、GST-GS16F8和GST-GS16F12的高效表达条件。.质谱鉴定纯化后GST-GS16F1，GST-GS16F4和GST-GS16F8的分子量与理论计算值完一致，它们的等电点和氨基酸组成测定结果也与理论值相符合。结果说明了设计的重组蛋白得到了正确表达。.3、 结构与性质分析.新鲜表达的F1难以形成稳定的分子构象，随着聚合度的增加，F8形成了典型的α-螺旋结构。超声波和恒温振荡处理后，分子构象向β-折叠转变，α-螺旋和无规卷曲的含量下降。.多肽F1、F4和F8没有细胞毒性，多肽F1、F4和F8接枝于涤纶材料后，细胞粘附性明显提高，细胞粘附紧密、充分铺展；细胞增殖活性强。