葡萄糖-6-磷酸酶基因新错义突变对酶蛋白功能及其降解的研究

糖原累积病(GSD)Ia型是由于葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)缺陷所致的较常见的常染色体隐性遗传疾病。通过前期研究，我们从90个患儿中发现了18种突变，其中9种为未报道的新突变，包括5种错义突变，它们对酶蛋白活性和稳定性的影响尚不清楚。近来发现泛素蛋白酶体通路是真核细胞内重要的非溶酶体降解途径，与分子伴侣协同参与突变或错误蛋白的清除或修复，本研究拟采用质粒构建、定点诱变、酶活性测定等方法探讨G6PC新错义突变对酶活性和稳定性的影响；选择2种可使蛋白降解明显加速的错义突变，通过蛋白酶体抑制剂、siRNA、免疫沉淀、Western blot等技术，考察泛素蛋白酶体、分子伴侣及共分子伴侣CHIP在G6PC错义突变体蛋白降解和折叠中作用及关系；旨在加深对本病分子病理机制的认识，探索G6PC基因结构与功能的关系，为今后开发新的疗法提供思路，更为研究真核细胞内突变蛋白的折叠和降解等现象提供启迪。

糖原累积病Ia型是由于葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)缺陷所致的糖原代谢障碍疾病。本研究明确了187例糖原累积病Ia患者基因突变谱，针对以往发现的8种新错义突变以及1种已报道的错义突变，采用质粒构建、酶活性测定及western blot等方法探讨G6PC新错义突变对酶活性、稳定性的影响及降解机制；选择可使突变蛋白降解加速的G266D突变，通过蛋白酶体抑制剂、siRNA、免疫沉淀、western blot等技术，探讨泛素蛋白酶体、分子伴侣热休克蛋白70/90(HSP70/90)和热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白(CHIP)在G6PC错义突变体蛋白降解和折叠中作用及关系。研究发现螺旋区6种错义突变(L225P,G266D, G272W,A274V, S326P,A331E)和非螺旋区2的L173P错义突变可使G6PC活性显著下降，而非螺旋区3的错义突变(L235P,T255P)则使酶蛋白留有10%活性，证实这9种错义突变均为致病突变，且跨膜区结构的完整性对酶活性至关重要。发现6种跨膜螺旋区错义突变和非螺旋区2突变(L173P)蛋白的表达量均较野生型降低，提示这7种突变对蛋白稳定性影响大，而非螺旋区突变(L235P、T255P)对蛋白稳定性影响小。蛋白酶体抑制剂MG132作用后G266D突变体蛋白表达量增加，而溶酶体抑制剂E64作用后蛋白表达量并未增加，G266D突变质粒与HA-泛素质粒共转染后发现突变体蛋白存在多泛素化现象，提示泛素-蛋白酶体通路参与了G266D错义蛋白的降解。免疫沉淀显示G266D突变体蛋白与Hsp70、Hsp90以及CHIP结合，提示分子伴侣参与了突变体蛋白的正确折叠与重构。G266D突变体蛋白在CHIP沉默后的表达量增多，而在CHIP过表达后的表达量减少提示CHIP可能作为分子伴侣和蛋白酶体的桥梁参与了突变体蛋白的降解。通过上述研究，我们认为G6PC错义突变蛋白经泛素-蛋白酶体通路降解，分子伴侣的参与促进突变体蛋白的正确折叠，CHIP作为分子伴侣和泛素-蛋白酶体的通路的中间桥梁促进突变体蛋白的降解。本研究加深了对本病分子病理机制的认识，探索了G6PC基因结构与功能的关系，为今后开发新的疗法提供思路，更为研究真核细胞内突变蛋白的折叠和降解等现象提供启迪。