蜱传布尼亚病毒SFTSV非结构蛋白NSs和脂质小滴相互作用及其机制和功能的研究

Severe fever with thrombocytopenia syndrome is caused by an emerging bunyavirus, called SFTS virus (SFTSV) and characterized by high fever, bleeding and multi-organ failure. We have reported that the nonstructural protein NSs of SFTSV formed inclusion bodies which appear to have special functions. First, NSs interacts with TBK1 and sequesters TBK1/IKKe/IRF3 complex into the inclusion bodies, a newly identified mechanism for viral immune evasion; Second, NSs formed inclusion bodies are lipid droplets (LDs) based and may be involved in viral RNA replication as a viral factory. This project aims to elucidate the function and molecular mechanism of NSs and its interaction with LDs in SFTSV infection. Specific aims include 1) to characterize the rols of LDs in viral factory and viral RNA replication in SFTSV infection; 2) to understand the mechanism how NSs interacts with LDs; and identify how SYNGR2 is involved in viral RNA replication by interacting with NSs and transforming LDs in SFTSV infection. This study will further our understanding of the dual-role function of NSs, its interaction with LDs and the significance of lipid mechanism in viral infection.

发热伴血小板减少综合症是由新型布尼亚科病毒SFTSV感染所致，以高热、出血和多器官衰竭为特征，病死率曾高达15%。我们发表的研究结果表明，SFTSV的非结构蛋白NSs可以形成具有特殊结构和功能的包涵体。首先，NSs通过和TBK1激酶相互作用，将TBK1/IKKe/IRF3复合物转位至包涵体中而抑制干扰素诱导，导致病毒免疫逃逸；其次，我们发现NSs形成的包涵体是以脂质小滴（脂滴）为基础，可能与病毒RNA增殖有关。本研究旨在阐明NSs在感染细胞中与脂滴的相互作用以及脂滴在SFTSV感染中的功能和机制。将探讨：1）脂滴在SFTSV感染中作为“病毒工厂”、影响病毒RNA增殖的功能；和2）NSs和脂滴相互作用、以及NSs和囊膜蛋白SYNGR2相互作用调控脂滴变构的分子机制。本研究对于阐明SFTSV非结构蛋白NSs的多功能性和病毒包涵体的作用，深入理解病毒感染机制中脂滴的特殊功能将具有重要意义。

本课题旨在研究脂滴在蜱传布尼亚病毒增殖和感染中的作用以及作用机制,项目起自2016年1月，终止于2019年12月。本项目有三项研究内容: 一、阐明脂滴在SFTS病毒感染增殖中作为病毒工厂的作用；二、阐明非结构蛋白NSs对脂滴变构、“病毒工厂”构建及病毒增殖的影响；三、阐明NSs和SYNGR2作用的分子机制及其对于脂滴变构和病毒增殖的影响。本研究确定了感染后细胞中病毒RNA聚合酶在NSs形成的包涵体中存在和集聚；证实了感染细胞中病毒RNA聚合酶与尼罗红荧光染料共定位，以及在脂滴中新生RNA和病毒RNA的合成；当细胞经脂代谢抑制剂处理、脂滴受抑制时，新生RNA合成和病毒增殖被抑制。这些结果提示脂滴的确可能是SFTS病毒在细胞中的病毒增殖复合体样结构，主要增殖病毒RNA，但病毒毒粒装配应该是在其它区域。本研究采用反向遗传体系构建了SFTSV病毒株和突变株，观察到NSs突变株病毒的增殖受到明显抑制，提示NSs在病毒增殖过程中起重要作用，可能一方面涉及到病毒增殖复合体样结构的形成及功能，另一方面则是由于NSs宿主免疫逃逸功能障碍所致。本研究发现，影响SFTSV增殖或免疫逃逸的病毒增殖复合体样结构改变与Synaptogyrin-2（SYNGR2）有关。通过特异性siRNA转染细胞，以调低SYNGR2 表达。在SYNGR2调低细胞系感染SFTSV，SYNGR2的上调受到明显抑制，在脂滴中与NSs共定位的SYNGR2量明显减少，病毒增殖受到抑制。我们进一步发现，SFTSV NSs作用于IRF7影响IFN-alpha表达。NSs可以和IRF7 直接作用将IRF7转位至病毒包涵体或脂滴样结构，结果病毒感染后期诱导IFN表达被抑制，IFN-alpha2和-alpha4诱导受影响，结果病毒增殖增强，此一结果也在用IRF7特异性的小RNA干扰细胞表达IRF7、再感染病毒的细胞中被观察到。我们最后发现，SFTS病毒NSs蛋白还可以跟天然免疫诱导干扰素的信号通路蛋白MAVS作用，并可以将其转运、隐藏到脂滴。这一过程同样可以被脂肪酸代谢抑制剂所抑制，直接影响到病毒感染细胞后不但抗病毒IFN的诱导受抑制，细胞炎症反应NFKB通路，即炎症细胞因子IL-6、IL-8和TNF-a诱导受影响。我们结论，脂滴和SFTS病毒NSs的相互作用对于病毒感染细胞，与细胞相互作用和在病毒发病机制过程具有重要作用。