泰勒焦虫表面蛋白Tams1 、SPAG1和TaSP的免疫原性研究

环形泰勒焦虫病是蜱传性血液原虫病。该病在新疆等北方牧区呈地方性流行，严重危害养牛业。传统血源细胞致弱苗对控制该病起了很大作用,但该苗存在携带病原的可能性，农业部已禁止其生产和应用。基因工程疫苗安全性、有效性优于传统血源苗，并有望替代传统疫苗。因此，焦虫发育阶段表面抗原亚单位疫苗是研究热点。.焦虫表面抗原基因：Tams1 、SPAG1及TaSP，单独表达时蛋白质三维结构不稳定，免疫原性较弱。本项目选择乙型肝炎病毒核心抗原（HBc）为展示骨架，分别用上述基因替换HBc的主要免疫优势区（MIR）及C-端核酸序列，构建真核表达载体，表达纯化HBc病毒样颗粒（VLP）嵌合蛋白，检测其免疫原性。根据免疫原性强弱，调整蛋白展示策略，最终筛选到高免疫原性嵌合蛋白。.本项目旨在以HBc VLP的刚性骨架支撑并有效展示焦虫表面抗原基因，通过检测嵌合蛋白免疫动物抗体水平，为焦虫基因工程疫苗的深入研究提供技术支持

生物学软件分析预测环形泰勒焦虫表面抗原蛋白Tams1、SPAG1及TaSP基因高免疫原性区域片段（321bp，324bp及372bp）。通过SOEing PCR在HBc的主要免疫优势区（MIR）及C-端区域骨架蛋白基因插入区两侧引入限制性酶识别序列。完成不同外源基因插入区不同表达系统HBc嵌合蛋白表达载体质粒构建（pDON-5-HBc-MIR、pDON-5-HBc-C、pPIC9K-HBc-MIR及pPIC9K-HBc-C）。将SPAG1、Tams1和TaSP基因分别插入pDON-5-HBc-C、pDON-5-HBc-MIR、pPIC9K-HBc-MIR及pPIC9K-HBc-C的相应外源展示区。免疫荧光、电镜观察及免疫印迹结果表明嵌合蛋白HBc-MIR-Tams1, HBc-C-TaSP, HBc-MIR-SPAG1，HBc-C-Tams1和HBc-MIR-TaSP可在293T细胞中表达，HBc-MIR-TaSP和HBc-C-SPAG1可以酵母中表达。嵌合蛋白免疫小鼠后检测血液细胞因子浓度及流式细胞分析T细胞亚群变化评价所免嵌合蛋白的免疫原性，结果显示：HBc-MIR-Tams1、HBc-MIR-TaSP(293T)、HBc-C-Tams1、HBc-C-TaSP及HBc-MIR-TaSP(GS115)免疫小鼠后均能刺激小鼠机体产生高浓度的细胞因子水平。小鼠中免疫原性好的嵌合蛋白组合HBc-MIR-Tams1-TaSP(293T)-TaSP(GS115) 、HBc-MIR-Tams1-MIR-TaSP(293T)-C-TaSP、HBc-MIR-Tams1-MIR-TaSP(293T)-C-Tams1与HBc-C-Tams1-C-TaSP-MIR-TaSP(GS115)免疫试验牛，通过MTT方法检测免疫牛淋巴细胞增殖情况而评价其免疫原性。结果显示筛选到的蛋白具有一定免疫原性，但免疫原性弱于泰勒焦虫虫体(T.annulata)疫苗。本研究为焦虫基因工程疫苗研究奠定基础。项目执行过程中，培养硕士研究生1名，发表CSCD文章1篇，发表中文核心期刊论文5篇，投稿SCI文章1篇“Immunogenicity of recombinant protein of Theileria annulata surface antigen ( Tams1, TaSP and SPAG1)”