小立碗藓调控细胞重新编程的miRNA鉴定及机制研究

The Physcomitrella patens is an irreplaceable model plant due to its high rate of homologous recombination, availability of whole genome sequence and strong capacity of cell differentiation, etc. It is important to study on cell reprogramming for its thereotical and practical significance. However, its regulation mechanism of plant is unclear. Recent researches showed that plant protoplast dedifferentiation is essentially identical to animal cell reprogarmming. Although protopolast is an ideal material for research on cell reprogramming, no significant progress has been made on the mechanism of molecualr regulation of cell reprogramming. We have successfully established the high frequent and synchronized protoplast regeneration system using P. patens and further compared expression characteristics of its miRNAs through high-throughput sequencing and digital analysis during dedifferentiation/cell reprogramming. As the continuation of the work, the target genes on miRNAs will be predicted using bioinformatics and identified by miRNA-mediated mRNA cleavage using a modified form of 5' RACE. miRNAs transgenic lines will then be produced according to the functional prediction of target genes (we have obtained one transgenic line and its protopolast regeneration is obviously decreased). Finally, by studying of cell morphology, DNA ploidy, chromatin remodeling, DNA methylation, histone acetylation, auxin distribution and concentration of wild type and transgenic lines, the molecular regulation mechanisms of plant cell reprogramming will be explored.

小立碗藓有基因同源重组率高、高质量全基因组序列、细胞分化能力强等特点，是不可替代的模式植物。细胞重新编程具重要理论和实践意义，但植物细胞重新编程分子调控机制不清。植物原生质体脱分化与动物细胞重新编程本质相同，是理想的研究材料，但其分子调控机制至今没有突破性进展。本项目以小立碗藓原生质体为材料，经高通量测序及数字化分析比较脱分化/细胞重新编程过程中miRNAs表达特征；用生物信息学分析技术预测miRNAs靶基因，用改良5'RACE法验证miRNAs对靶基因切割特性，鉴定预测的靶基因；结合前期转录组和蛋白组数据分析靶基因功能，筛选出两个新的重要miRNAs，用同源重组技术获得性状稳定的转基因株系（目前获得一转基因株系原生质体再生能力明显降低），进而从细胞形态、DNA倍性变化、染色体重塑、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、生长素调节等方面剖析miRNAs生物学功能，探索植物细胞重新编程的分子调控机制。

小立碗藓具有基因同源重组频率高、高质量全基因组序列、细胞分化能力强等特点，是不可替代的模式植物。细胞重新编程具有重要的理论和实践意义，植物原生质体脱分化即细胞重新编程，其分子调控机制至今没有突破性进展。本项目以小立碗藓原生质体为材料，研究植物体细胞获得全能性（细胞重新编程）的调控机制。分析了小立碗藓在形成原生质体和原生质体再生过程中蛋白质组和转录组（mRNAs和miRNAs）的变化，建立了植物在细胞重新编程中的分子调控网络。筛选出一些在形成原生质体和原生质体再生过程中表达量变化比较大的miRNAs，结合蛋白质组和mRNAs组的数据以及miRNAs靶基因的功能，推测其可能和细胞重新编程相关。.对新发现的小片段RNAs进行验证，用软件分析其前体结构具有颈环结构，用Northern blot鉴定了其前体的存在，并用5´RLM-RACE验证了其剪切的靶基因，与软件预测的一致，证明了这些小片段RNAs是新发现的miRNAs。.对重要的miRNAs进行深入的生物学功能研究，构建2个miRNAs及其靶基因的过表达载体和敲除载体，通过PEG介导的原生质体转化获得其转基因株系。对与AUX/IAA相互作用的miRNA的转基因株系从表型、成活率、DNA倍性变化、DNA甲基化和染色体重塑等方面验证其功能，指出了生长素在植物获得全能性中的调控机制。与组蛋白去乙酰化酶相互作用的miRNA，在调控茎叶体的生长方面具有重要的作用。.本项目运用转录组学和蛋白质组学的方法，阐明植物在“脱分化”（细胞重新编程）过程中的分子调控网络；应用“同源重组”技术“定点”基因敲除和过量表达相关的miRNAs，剖析其在“脱分化”（细胞重新编程）过程中的重要作用，从而揭示miRNAs在原生质体“脱分化”过程中的调控机理，探索相关信号传导途径。为植物体细胞的再生提供理论依据，从而为通过基因工程获得优良性状的品种奠定基础。