以D-阿洛糖为底物研究Agrobacterium tumefaciens来源的L-鼠李糖异构酶的催化机理

稀少糖是自然界中存在量极少，但具有独特的生理学功能的一类单糖。在其生物转化方法-Izumoring策略中，醛酮异构酶是实现醛糖与酮糖相互转化的关键酶，是整个稀少糖转化链中必不可少的一环。目前可利用的醛酮糖异构酶还很少，这些酶对于底物的选择性差、催化活力低，严重制约着功能性稀少糖的转化。本研究将在综合几种不同异构酶对底物的识别机理基础上，主要探索Agrobacterium tumefaciens来源的L-鼠李糖异构酶（L-RhI）与D-阿洛糖的结合与催化作用。首先构建该酶的异源表达系统，对重组蛋白进行纯化，分析其各项酶学性质；然后通过蛋白结晶及X-射线衍射等方法，以该酶蛋白、酶-底物复合体为研究对象，分析该酶对D-阿洛糖的催化活性区；进一步利用定点突变等分子生物技术，定向改造并提高该酶对D-阿洛糖的选择性，揭示以D-阿洛糖为底物的A. tumefaciens L-RhI的催化机理。

L-鼠李糖异构酶（L-RhI）是稀少糖生物合成策略中一个重要的醛酮异构酶，它可以实现D-阿洛酮糖与D-阿洛糖之间的相互转化。提高L-RhI对D-阿洛酮糖或D-阿洛糖的底物选择性是目前的研究热点。本项目以A. tumefaciens L-RhI为出发酶，利用理性与非理性设计相结合的蛋白改造策略，建立了L-RhI的定向进化实验方案，并获得了优势突变体。.首先，项目分析比较了几种常用的检测方法，如液相色谱法和UV检测法等，并首次利用了等温滴定微量热解决了稀少糖的转化检测难题，研究了L-RhI的酶学性质与催化动力学特点。这种方法因为灵敏度高，干扰较少，不需要分离底物和产物，在糖转化分析中具有一定的优势。.第二，横向比对C. thermocellum RpiB、S. rubiginosus D-XI、P. stutzeri L-RhI等酶对于底物D-阿洛糖的催化机理，并以P. stutzeri L-RhI的晶体结构为模板模拟了A. tumefaciens L-RhI的结构，对接分析了其与底物的作用位点，用理性设计的方法，设计了一系列的突变位点，定点突变获得了优势突变体F66Y，发现其对D-阿洛酮糖与D-阿洛糖的底物选择性均有不同程度的提高。.第三，利用吡喃糖氧化酶与过氧化物酶双酶偶联体系，构建了高效的D-阿洛糖检测方法与D-阿洛糖生产菌株的高效筛选方法。在定点突变的基础上，进一步利用定点饱和突变、随机突变及模板交错延伸，获得了高底物选择性的A. tumefaciens L-RhI的突变株，并利用模拟与对接等手段对野生型和突变体了进行了催化机理分析。.最后，偶联D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，以果糖为底物，转化生产D-阿洛酮糖与D-阿洛糖。当D-果糖浓度为2%时，反应到达平衡时，D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的产量分别为5.12和2.04g/L。