酪氨酸蛋白激酶的自磷酸化分子机制

Protein tyrosine kinases (PTKs) are important regulators of intracellular signal transduction pathways. Dysregulation of PTKs is found to participate in numerous human diseases, such as cancers, diabetes, inflammation, severe bone disorders, arteriosclerosis and angiogenesis. Autophosphorylation is a key step in the activation processes of many PTKs. Autophosphorylation of tyrosine(s) in the activation loop within the kinase domain results in stimulation of kinase activity for PTKs to catalyze the downstream targets in the cell signaling pathway. Here, we propose to unravel the autoactivation mechanisms of several important PTKs, such as Src, Abl, cKit, IGF1R and FGFR. We will investigate the initiation and amplification process of autophosphorylation, the effect of small molecule inhibitors on PTK activity and the abilities of drug-resistant PTK mutants to undergo autophosphorylation. In addition, we will study the autophosphorylation/dephosphorylation circuit in Src signaling using system biology approaches. The results would not only improve our understanding of PTK regulation, but also shed new insights into the development of PTK-targeted drugs.

酪氨酸蛋白激酶PTK是细胞信号通路中的重要参与者，它们的异常激活与多种人类疾病密切相关，包括癌症、糖尿病、炎症反应、骨骼疾病、动脉硬化和血管生成等。多种酪氨酸蛋白激酶的活化都必须经历自磷酸化反应这一过程，该反应发生在PTK激酶结构域活化环上保守的酪氨酸位点上，磷酸化后激酶结构域转变为一个稳定的活性构象，得以催化下游底物以传递信号。本项目主要研究酪氨酸蛋白激酶通过自磷酸化反应进行自激活的调控机制，主要涉及Src、Abl、cKit、IGF1R和FGFR这几个PTK蛋白分子，研究它们活化环上关键酪氨酸残基自磷酸化的分子机制、小分子抑制剂对自磷酸化反应的影响以及一些耐药性突变体的自磷酸化机制，并从Src入手，对蛋白质自磷酸化/去磷酸化环路进行系统生物学方面的研究。这些研究将加深人们对这些酪氨酸激酶自磷酸化分子机理的了解，同时也为相关的药物设计提供坚实的理论基础。

自磷酸化自激活是蛋白激酶中一种独特的调控机制，磷酸化后蛋白激酶得以激活，催化下游底物和传递信号。既然磷酸化是形成活性酶的必要条件，那么非磷酸化的蛋白激酶为何具有自催化能力呢？本项目的初衷是从一些经典的哺乳动物酪氨酸蛋白激酶入手，研究酪氨酸蛋白激酶的自磷酸化/自激活机制。由于蛋白重组表达和均一性磷酸化蛋白样品的制备遇到较大障碍，我们并未获得可以用于自磷酸化酶动力学分析和结构生物学研究的蛋白样品，但在蛋白激酶自磷酸化/自激活机制研究这一大方向下，我们对植物油菜素甾醇（BR）的受体激酶BRI1和共受体激酶BAK1、受自磷酸化调控的蛋白激酶PAK2、以及负调控蛋白激酶活力的蛋白磷酸酶MKP和Calcineurin开展了结构和功能研究，取得了多项重要进展。（1）与哺乳动物的受体酪氨酸激酶类似，植物中激素分子与其受体胞外端的结合经常使受体胞内端的激酶结构域发生自磷酸化。植物BR信号通路是由受体激酶BRI1和共受体BAK1所起始的，我们解析了BRI1激酶结构域与其抑制蛋白BKI1的BIM片段的复合物晶体结构，分析了BRI1和BAK1胞内端片段的自磷酸化及交互磷酸化过程，提出了较为清晰的BRI1-BAK1受体胞内端作用模型。（2）PAK蛋白激酶是重要的药物靶标，可以自磷酸化自激活。我们对PAK2激酶结构域片段（PAK2-KD）的自磷酸化/自激活过程进行了详细的酶动力学分析，阐明了其自磷酸化的分子机制。我们解析了非磷酸化PAK2-KD的晶体结构，并进行了分子动力学模拟研究，发现非磷酸化PAK2-KD已经具有部分活性酶特征，具备催化分子内自磷酸化反应的结构基础。（3）自磷酸化蛋白激酶的负调控主要由多种蛋白磷酸酶催化关键位点的去磷酸化来完成。我们通过结构和生化方法研究了双特异性磷酸酶MKP7与其底物JNK蛋白激酶的识别机制。我们还解析了迄今为止最完整的钙调蛋白磷酸酶（Calcineurin，CN）的晶体结构，指认了新的自抑制片段AIS，并修正了CN的调控机制模型，解决了该领域存在的多个矛盾问题。上述研究成果大大促进了人们对自磷酸化蛋白激酶活力调控分子机理的认识。