原花青素通过FoxO/Wnt促进人牙髓干细胞氧化应激修复的研究

There are many types of dental treatment which leads to high level of reactive oxygen species（ROS） in dental pulp cells.It is generally believed that excessive accumulation of ROS causes oxidative stress(OS) and destroys proteins, lipids, and DNA, consequentially induces changes in cell bio-behavior. It was proved in our previous study that hydrogen peroxide promoted the odontogenic differenciation of dental pulp cells in low level while high level of hydrogen peroxide showed cytotoxity. Proanthocyanidin(PA) is an widely used effective antioxidant, which is rich in plants especially grape seeds. We have found that PA increased expression of odontogenic differenciation related genes in DPCs. Therefore, PA is an potential new capping agent. According to previous studies, It is possible that PA attenuated the deleterious effects of OS on odontogenic differentiation and the underlying mechanism may be involved in antagonizing the suppressing effects of OS via promoting the activation Wnt signaling and simultaneously abrogating the activation of FoxO pathway. To prove this hypothesis, FoxO and Wnt signaling will be detected while PA was used with or without OS, activator and suppressor of FoxO and Wnt pathway. RNA interference and luciferase reporter gene technology will be used to investigate the mechanism. The goal of this study is to provide theoretical basis for the found of new capping agent and make progress in odontogenic differentiation theory.

多种牙科治疗会导致牙髓细胞内活性氧水平升高，造成细胞氧化应激，影响细胞生物学行为。本课题组前期研究发现过氧化氢具有细胞毒性，而较低浓度过氧化氢则促进牙髓细胞矿化。原花青素是一种已被广泛应用于多种疾病防治的天然强效抗氧化剂，富含于葡萄籽等植物中，课题组前期研究发现适宜浓度的原花青素促进牙髓细胞矿化基因的表达，提示其可能作为盖髓剂或过氧化保护药物用于口腔临床治疗。细胞内活性氧水平过高时，可能通过激活FoxO通路继而抑制Wnt通路的机制阻碍牙髓细胞矿化，而原花青素可能减弱此效应，这可能是牙髓细胞矿化的新机制。为证明此假设，本课题将原花青素应用于常规与氧化应激状态下的牙髓细胞，结合通路的抑制剂和激活剂，观察其对FoxO及Wnt通路及牙髓修复能力的影响，并使用RNA干扰及荧光酶报告基因等生物学技术，进一步阐明此分子机制。旨在为寻找安全有效的盖髓剂提供依据，并完善牙髓修复机制的理论。

研究目的：确认氧化应激状态对人牙髓干细胞活性与修复能力的影响；研究原花青素通过对抗氧化应激状态，促进牙髓干细胞形成修复性牙本质的效应；探讨原花青素产生抗氧化应激作用的分子机制。材料与方法：1.不同浓度过氧化氢和原花青素作用于细胞后，从对细胞活性及分化的影响挑选出原花青素最佳作用浓度；2.通过Western blot技术检测原花青素与Wnt通路抑制剂Dkk-1对HDPCs通路关键分子β-catenin表达的影响，观察Wnt信号通路的激活情况；3.通过荧光素酶报告基因方法检测FoxO和Wnt通路下游转录因子活性，探讨原花青素抗氧化应激的分子机制；结果：1. 100μmol/L H2O2处理4h诱导大量细胞坏死，5-20mg/L的原花青素对HDPCs活性无明显影响，且能抑制H2O2引起的细胞活性降低；原花青素在5-20mg/L 范围内随着浓度增加，促进人牙髓细胞碱性磷酸酶活性增强，矿化基因表达水平提高以及钙结节形成增加；20mg/L的原花青素促进HDPCs在裸鼠背部皮下形成牙本质样结构；2. 原花青素能够上调牙髓细胞β-catenin的表达，且在30分钟达到高峰；300μg/L的Dkk-1作用于细胞2h，能够抑制原花青素引起的β-catenin上调；采用Dkk-1作用于HDPCs细胞后，原花青素促进牙髓干细胞矿化的效应减弱。3. 原花青素提高Wnt通路靶基因Axin2、ALP、OPG mRNA的表达水平及转录因子Tcf转录活性，降低FoxO3a通路靶基因Gadd45和CAT的mRNA表达水平和转录因子Tcf转录活性。结论：1.H2O2能够诱导牙髓细胞凋亡和坏死，对细胞产生损伤；2. 5-20mg/L的原花青素对牙髓细胞不具有明显毒性且能够对氧化应激的人牙髓细胞起到保护作用；3.原花青素能够促进牙髓细胞体外成牙本质分化及在动物体内形成牙本质样结构；4. 原花青素通过下调FoxO及上调Wnt通路产生抗氧化应激作用。