配体依赖的ERs-AF2在牛卵泡体外成熟与排卵中的分子机制

The productivity of high-yielding cows was affected directly by maturation and ovulation of ovarian follicle. Estrogen is come from the follicle, but also one of the main regulators of follicular maturation and ovulation. The domain of activation function 2 in estrogen receptors (ERs-AF2) plays an important role in many tissues because that is the binding site of estrogen and also the start point of estrogen signaling transduction. However, the molecular mechanism of ERs-AF2 on maturation and ovulation of bovine follicle in vitro is keeping unclear. In current proposal, in vitro cultured bovine preantral follicle and granulosa cells are used to be research models ,and the function of ERs-AF2 in follicle and granulosa cells is regulated by selective estrogen receptor-AF2 modulators (SERMs) and also regulated by transfection of adenoviruses vector mediated ERs-AF2. All these treatments will be used to study the spatial and temporal expression profiling of related genes affecting the function of ERs-AF2 in the follicles; to analyze the effects of ERs-AF2 on proliferation and differentiation of granulosa cells, pathway and networks of steroid hormone synthesis and secretion in granulosa cells; to explore the principles of ERs-AF2 on peroxidation and apoptosis of granulosa cells mitochondria. It will be clarified that the precise regulation fundamental of ERs-AF2 on maturation and ovulation of bovine ovarian follicle, and provided data reference to establish protecting mechanism of ovaries for high-yielding cows, and it has important practical value for promotion of basic research of animal reproduction, strengthen the application of modern technology of animal reproduction and improving the productivity of cows.

高产母牛卵泡成熟与排卵直接影响其生产力。雌激素来源于卵泡，又是卵泡成熟与排卵的主要调节因子之一。雌激素受体转录激活区AF2（ERs-AF2）是雌激素的结合位点，也是其信号传递的起点，在不同组织中起着重要作用。然而，关于ERs-AF2在牛卵泡体外成熟与排卵中的分子机制还不清楚。本项目以体外培养的牛腔前卵泡和颗粒细胞为研究模型，利用选择性调节剂（SERMs）与腺病毒载体转染等方法调节ERs-AF2的功能，研究影响ERs-AF2功能的相关基因的时空表达谱；解析ERs-AF2调控牛卵泡颗粒细胞增殖与分化、类固醇激素合成分泌途径与网络；探索ERs-AF2调节颗粒细胞线粒体过氧化作用与细胞凋亡原理。拟阐明ERs-AF2精准调控牛卵泡成熟与排卵中的基本原理，为建立高产母牛卵巢功能保护机制提供数据参考，对有效推动动物繁殖学的基础研究，加强现代动物繁殖技术应用和提高母牛生产力具有重要意义。

牛卵巢上约99％的卵泡因闭锁退化而不能排卵，这是母牛繁殖效率低下和遗传资源浪费的主要原因。雌激素受体（ERs）作为卵泡发育的重要转录因子之一，主要通过实现雌激素的功能以调控颗粒细胞的存活、增殖和分化，但具体调控机制尚不清楚。因此，本项目通过研究 ERs介导的牛卵巢卵泡体外生长与血氧浓度关系研究； ERβ通过结合PHB2调控卵巢颗粒细胞自噬；花生四烯酸（AA）调控卵泡颗粒细胞ERs的表达机制研究及 ERa 介导的miR-21-3p对卵泡颗粒细胞自噬的作用研究等，获得如下主要结果：（1）低氧调节ERs的表达而抑制牛卵泡体外生长；（2）AA通过调控ERs的表达而影响牛卵巢卵泡颗粒细胞的存活与功能；（3）过表达ERa抑制miR-21-3p后，细胞自噬标记基因Lc3、Becn-1等的mRNA表达水平及自噬标志蛋白LC3的表达量均显著低于对照组（P < 0.05），表明牛卵巢颗粒细胞（BGCs）中ERa的过表达抑制了细胞自噬标志基因Lc3、Becn-1、Atg3、Atg5和Atg7的表达；（4）双荧光素报告基因实验显示miR-21-3p与VEGFA和FGF2基因的3’UTR具有靶向关系；（5）在牛颗粒细胞中ERa抑制miR-21-3p的表达，可以通过激活PI3K/AKT通路的磷酸化水平促进颗粒细胞自噬；（6）ERβ在诱导卵泡闭锁过程中起重要作用；（7）PHB2对GCs自噬有调控作用，过表达PHB2诱导GCs自噬；（8）ERβ与PHB2在细胞中形成蛋白复合物进而诱导GCs自噬，且在缺失ERβ或PHB2时无法引起自噬；（9）ERβ与PHB2在细胞中形成蛋白复合物通过AKT/mTOR信号通路进而诱导GCs自噬，且在缺失ERβ或PHB2时无法引起自噬。以上研究结果证明了ERs在牛卵泡发育与闭锁中的重要作用机制，为提高牛卵巢卵泡的利用率提供了理论支撑，为提高牛的繁殖能力打下了基础。