软骨细胞Neuroleukin的分泌对自身表型维持的影响及在软骨损伤修复中的作用

Autologous chondrocyte implantation(ACI) is the first treatment option for young and middle-aged patients with articular cartilage injury, but its really an obstacle that culturing in-vitro leads chondrocytes to loose cartilaginous phenotype. In our previous study we have demonstrated that expression of Neuroleukin declines during dedifferentiation process of chondrocytes and corroborated the cytomembrane locolization of its receptor AMFR/gp78. The results above indicate the possibility that NLK and AMFR/gp78 involve in phenotype maintenance of articular chondrocytes. NLK was first found secreted in tumor cells, and act also as glycolytic enzyme and neurotrophic factors in normal tissues. In osseous tissues, NLK was reported to promote mineralization of osteoblasts and play a possitive role during fracture healing process. In this study, RNAi technique will be used to knockdown NLK and AMFR/gp78 respectively to analyze the phenotype maintenance effect of NLK in chondrocytes. Secondly, detect the expression of NLK after cartilage injury and application prospect of NLK in ACI to repair articular cartilage defects.

自体软骨细胞移植是青中年关节软骨损伤患者治疗的优先选择，但体外扩增过程使软骨细胞暂时失去了体内环境导致表型丢失，成为软骨细胞移植的难题。我们前期研究首次发现软骨细胞内多功能蛋白Neuroleukin(NLK)能够被软骨细胞分泌，且其分泌和在细胞内的表达水平随软骨细胞体外去分化而明显下降；另外，在软骨细胞膜发现了NLK的受体AMFR/gp78的存在，以上前期工作提示在生理状态下NLK很可能通过其受体介导参与维持软骨表型。本研究通过分别敲低NLK和AMFR/gp78研究软骨细胞NLK的分泌对软骨细胞表型维持、基质分泌的影响，建立软骨损伤模型研究软骨损伤后NLK表达和分泌水平的变化，最后利用NLK进行自体软骨细胞移植修复软骨缺损并做组织学评价，为明确NLK对软骨表型的作用并将NLK应用于软骨损伤的治疗提供理论依据。

本项研究在项目执行期间主要完成了以下内容：项目进行的第一阶段成了对表层、中深层软骨细胞之间的表型调控基因表达、蛋白合成和增殖能力差异的检测；完成了Neuroleukin-AMFR/gp78敲低细胞系的构建及内源性Neuroleukin分泌检测；此外，完成了Neuroleukin-AMFR/gp78对软骨细胞周期及表型蛋白调控的检测。本阶段的研究表明：关节软骨Neuroleukin的自分泌及外源性Neuroleukin都能够通过其膜受体AMFR/gp78促进软骨细胞增殖，且这种增殖能力的促进作用完全依赖于其膜受体AMFR/gp78的表达。根据我课题组前期研究的结果，本课题组在项目进行的第二阶段，利用海藻钠凝胶体外三维培养体系，研究了不同层来源的软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养后，其表型调控蛋白的表达变化及细胞外基质分泌特异性的维持情况。在本项目进行的第三阶段，我课题组对软骨细胞组织工程支架进行了创新，课题组发现聚癸二酸丙三醇甘油酯(PGS)是一种人工合成的高分子聚合弹性体材料，具有良好的生物降解能力和组织相容性，但存在降解速度过快和力学强度低的缺陷，而聚已内酯(Polycaprolactone, PCL)是一种半结晶的生物可降解高分子材料，降解速率较慢，具有一定的力学强度和韧性，可以弥补PGS的缺陷。课题组通过实验研究制备了PGS-PCL复合材料软骨细胞支架，并通过改变复合材料的摩尔比，对其刚性、韧性、降解周期进行了优化。制备了PGS-PCL复合材料软骨组织工程支架，用于软骨损伤修复的实验研究，为软骨缺损的修复提供新方法。