噬菌体Red重组系统用于高等植物叶绿体转化的研究

目前，潜力巨大的叶绿体转化尽管对一些高等植物取得了成功，但成熟稳定的体系建立仍旧局限于烟草中，问题的主要根源可能在于叶绿体自身RecA类DNA同源重组方式介导的初始基因转化效率普遍低下。基于此，本工作将创新地引进一种简单高效、通用灵活的遗传转化驱动机制- - Lambda 噬菌体Red重组系统，探索它用于高等植物叶绿体转化的可行性，期望它能有效促进叶绿体转化。在具体工作中，拟采用五种不同的策略，通过载体构建和使用必要的植物转化手段，为叶绿体内提供Red重组酶功能，以驱动叶绿体基因打靶分子与叶绿体基因组之间的同源重组。最后，通过比较分析确定Red重组介导叶绿体转化的最佳模式，以便推广用于其它高等植物品种中，从而真正使叶绿体转化技术成为植物功能基因组学和遗传工程研究的重要手段。

本着叶绿体和细菌间的进化关系和遗传共性，本项目试图将噬菌体Red重组异源引入到叶绿体，以为大肠杆菌中卓有成效的Red重组应能促进植物叶绿体转化并拓展它的应用面，并为此努力实施。然而事与愿违的是，我们没有获得Red重组介导的叶绿体转基因烟草植株，预期目标落空。细致勘查原因后基本推定Red重组介导叶绿体转化在理论上具有项目申请当初还无法预知的不可行性。不过在植物组培间隙期，我们还开展了其它方面有意义工作并取得一定进展：①超酸性蛋白融合伴侣对蛋白聚集的抑制作用。蛋白聚集严重制约各种蛋白研究而且引发很多疾病。我们发现超酸性蛋白（大肠杆菌yjgD、msyB、rpoD的N端区）作为融合伴侣能显著抑制疾病关联、易形成淀粉样/纤维的多肽（TEL-SAM、Ab42）聚集；而且对易聚集靶蛋白来说，其超酸性融合蛋白同源物还能起着分子间增溶作用。该工作为抑制蛋白聚集及相关研究提供了一个新的思路。②植物Rubisco活化酶RCA的热稳定性改良。RCA特异调节光合作用关键酶Rubisco的活性，但热稳定性差而被视为光合作用温敏主要决定因子。本工作首次采取融合基因策略并鉴定出一些具超酸特性的通用热稳定性增强接头（人ATS、拟南芥ATTa、大肠杆菌yjgD和msyB），提高了所有四种植物RCA的热稳定性。③植物抗坏血酸过氧化物酶APX1的热稳定性改良。APX1是活性氧清除系统中核心抗氧化酶，在植物抗逆中具有普适性。但它遇热易失活，可能是植物对高温敏感的重要起因。本工作同样首次应用融合基因策略提高APX1热稳定性，发现前面超酸性融合接头均能增强小桐子APX1（JcAPX1）的热稳定性，且使其融合蛋白的酶活性在适度高温下得以维持，较原始JcAPX1的酶活耐热性提高至少2 ℃（高达5 ℃）。类似作用可能同样适用于低温植物拟南芥APX1。因此，采用超酸性功效接头的融合基因策略是提高蛋白热稳定性的简捷有效通用手段，有利于提高植物耐热性、光合效率和产量，特别对低温生长作物可能更具意义。④小桐子全转录组测序及冷胁迫下的基因表达谱分析。通过二代测序获悉了小桐子全转录组，共45251个独立基因。着重分析冷胁迫下表达差异最显著基因说明：肌醇半乳糖苷和棉子糖在小桐子抗冷中可能作为主要的小分子糖类渗透保护剂，磷脂酶Dδ可能主导ABA非依赖冷信号传导途径中的胞质Ca2+快速上升。该工作有助于植物抗冷性的深入了解和遗传改良。