miR-23b启动子甲基化调控在TGF-β1诱导的气道平滑肌细胞增殖中的作用及其机制研究

Proliferation of airway smooth muscle cells (ASMCs) plays a key role in airway remodeling in asthma. Our previous studies have proved that miR-23b crosstalks with TGF-β1/TGFβRII/Smad3 signaling and modulates the proliferation of ASMCs. However, the mechanism that TGF-β1 modulates miR-23b expression is unclear. Our preliminary studies show that TGF-β1 down-regulates miR-23b in ASMCs, and the effect can be attenuated by a DNA methyltransferase inhibitor. Accordingly, TGF-β1 might modulate miR-23b expression and ASMC proliferation by enhancing methylation in the promotor of miR-23b. In this study, we will explore the effect of TGF-β1 on expression of miR-23b and proliferation of ASMCs by primary ASMC culture. In addition, we will validate the regulatory mechanism of miR-23b expression in vivo via establishing a mouse model of asthma. Our study will further elucidate the epigenetic regulation of airway remodeling in asthma, and illustrate the therapeutic potential of miR-23b.

气道平滑肌细胞增殖在哮喘气道重塑中起重要作用。我们的前期研究已证实miR-23b与TGF-β1/TGFβRII/Smad3信号通路交互作用调控气道平滑肌细胞增殖，然而TGF-β1调控miR-23b的机制尚不明确。我们的预实验结果表明，TGF-β1刺激可显著下调气道平滑肌细胞中miR-23b表达，且DNA甲基转移酶抑制剂可显著抑制TGF-β1诱导的miR-23b下调。据此我们提出，TGF-β1很可能通过增强启动子甲基化调控miR-23b表达，进而影响气道平滑肌细胞增殖。本项目拟首先体外培养原代小鼠气道平滑肌细胞，探究TGF-β1调控气道平滑肌细胞miR-23b表达的机制，及其对气道平滑肌细胞增殖的影响。然后构建小鼠哮喘模型，在体验证miR-23b在哮喘气道平滑肌细胞中的调控机制。本项目有助阐明气道平滑肌细胞参与哮喘气道重塑的表观调控机制，为确立miR-23b作为哮喘治疗的新靶标提供科学依据。

持续的气道炎症及不可逆的气道重塑是慢性哮喘的主要病理特征。气道上皮细胞-间充质转化是气道重塑的典型病理表现。既往研究表明，miRNA以及包括DNA甲基化在内的表观调控在哮喘的发病机制中起重要作用。本课题组前期研究表明，miR-23b-3p在哮喘气道重塑中起重要调控作用，且miRNA启动子常位于DNA的CpG岛，易受DNA甲基化调控。因此，本项目着重研究miR-23b-3p及其启动子甲基化在哮喘气道重塑过程中的调控作用及机制。我们首先采用卵白蛋白致敏法构建小鼠慢性哮喘模型，采用H&E、PAS及Masson三色染色分析各组小鼠气道病理改变。采用RT-qPCR及荧光原位杂交技术检测miR-23b-3p的表达，采用RT-qPCR、免疫印迹及免疫组化法检测DNA甲基化转移酶及上皮细胞-间充质转化相关标记分子，并采用基因测序及甲基化特异性PCR法检测启动子区甲基化水平。我们进一步构建过表达及敲低miR-23b-3p的气道上皮细胞及慢性哮喘动物模型以进一步明确miR-23b-3p在气道上皮细胞-间充质转化及气道重塑中的作用。最后我们采用双荧光素酶等技术探究miR-23b-3p的下游信号分子。我们的研究结果显示，模型组小鼠肺组织出现严重的气道炎症及重塑，并且模型组小鼠气道上皮细胞内上皮标记降低而间质标记明显升高提示存在上皮细胞-间充质转化。同时，模型组小鼠肺组织内（特别是气道上皮细胞内）DNMT3a及DNMT3b表达明显降低，而miR-23b-3p表达明显升高。离体实验采用TGF-β1诱导气道上皮细胞间充质转化，结果同样表明间充质转化的上皮细胞内DNMT3a、DNMT3b表达降低及miR-23b-3p表达升高，并且miR-23b启动子区域甲基化水平明显减低。同时，我们发现DNA甲基化酶抑制剂可提高气道上皮细胞中miR-23b-3p的表达。后续的研究，我们确定了miR-23b-3p的下游信号分析为PTEN。敲低PTEN可抑制上皮细胞间充质转化。最后，我们在体敲低哮喘模型小鼠气道上皮细胞miR-23b-3p，结果显示敲低miR-23b-3p可明显抑制气道重塑及上皮细胞-间充质转化。综上，我们的研究证实了miR-23b-3p及DNA甲基化调控在哮喘气道重塑中及上皮细胞间充质转化中的重要作用，并且明确了上下游机制。本研究对探究防治哮喘气道重塑的新靶点方面，具有重要科学意义及价值。